血细胞怎么做计数实验？

实验

阳性细胞计数怎么保证位置(细胞阳性率小于10%)阳性细胞计数怎么保证位置(细胞阳性率小于10%)


阳性细胞计数怎么保证位置(细胞阳性率小于10%)


目的原理 了解血细胞计数的原理并掌握红细胞、白细胞、血小板计数的方法，红细胞计数结果结合血红蛋白值还可以计算出红细胞平均血红蛋白量(MCH)可作为生理机能检查和临床诊断的指标。用相应的稀释液将血液稀释若干倍(另有抗凝、固定、着色作用)，置于计数室中，在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。 稀释血液有血细胞吸管法和法，本实验采用后者。

实验对象与用品 鸡或家兔。血细胞计数板、专用盖玻片、吸血管、显微镜、手揿计数机、血细胞稀释液、拭镜纸、毛笔。

方法步骤

(一)熟悉计数室

血细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板在横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格。四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６，也有的计数板为１６×２５的，小方格面积一致)。大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。

(二)红细胞计数

先用稀释法制备禽类血细胞悬液：将禽类红细胞稀释液Ⅰ、Ⅱ分别置水浴锅中预热到４１～４２℃，取Ⅰ液１mL于中，用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)２０霯，再加入Ⅱ液１mL混匀，置该水浴锅中保温５０s左右，置室温，即为待检的血细胞悬液。可用于充液计数。取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度，认清 计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。

(三)血小板计数

采取血液并立即与抗凝剂混合(由于血小板具有趋向于凝集和粘附于异物表面的特性)。以血小板稀释液(１０％EDTANa2 １０mL与０.８％NaCl９０mL组成)将血液稀释２００倍，混匀后滴入血细胞计数室内，静置１５min，待血小板下沉后。于高倍镜下计数(同红细胞 计数)。在高倍镜下血小板呈椭圆形、圆形或不规则的折光小体分布于红细胞间，注意与杂质相区别。也可用复方尿素稀释液稀释血液，应静置２０min以上，待红细胞充分溶解后再充液计数。

(四)计算

按计数室构造及血液稀释倍数,将血细胞计数结果换算成每立方毫米中血细胞的个数。以每１００mL血液中的血红蛋白量（g）乘以１０再除以红细胞数（106/mm3）得红细胞平均血红蛋白量（MCN，单位μμg）。

(五)仪器洗涤

计数板、盖玻片和测定管用清水冲洗，再用绸布或细布沾干。

要求与思考题

１.计算结果，报告中简要说明计算过程。求出本组同学测定的均值并评价之。

２.了解各类稀释液成分，分析各物质的作用。

注意事项

１.充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计

数。

２.计数板、盖玻片、吸血管及测定管等用过后必须立即按要求洗涤干净。

组织建议 将相同类型的计数板集中在一个组内，便于指导。本实验属于基本作，各位朋友均应作得出结果。

附注：

1.本法可同时计数禽类白细胞数，计算方法也类似。

2.禽类血细胞稀释液为：

Ⅰ液

中性红 25.0mg

NaCl 0.9g

加蒸馏水至100.0mL

Ⅱ液

结晶紫 12.0mg

柠檬酸钠 3.8g

0.8mL

加蒸馏水至100.0mL

3.哺乳类红细胞稀释液可用生理盐水或阿扬(Hayem)氏液(NaCl 1g，Na2SO4·10H2O 5g，HgCl2 0.5，加蒸馏水至200mL过滤)。白细胞稀释液成分为冰醋酸0.1mL，1%龙胆紫1mL加蒸馏水至100mL，或直接用2%。

4.血小板复方尿素稀释液配方为：尿素10g，柠檬酸钠0.5g，甲醛0.1mL，加蒸馏水到100mL，混合，待完全溶解后过滤。置冰箱内可保存1～2周。

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如何计数组织染rdu阳性细胞

细胞增殖的检验方法：BrdU标记法

1、细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0 期。

2、终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L），37℃，孵育40min。

3、弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。

4、甲醇/醋酸固定10min。

5、经固定的玻片空气干燥，0.3％H2 O2 -甲醇30min灭活内源性氧化酶。

6、5％正常兔血清封闭。

7、甲酰胺100℃，5min变性。

8、冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。

9、按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。

为什么细胞计数时数上不数下，数左不数右呢

因为计数的原理是一个大方格（16个小方格）是0.1ul的细胞液。这0.1ul就分布在这个正方形内，但有些细胞在边缘压线，它只有部分在方格内，如果上下都计的话，细胞数就不是0.1ul里面的了，得到的细胞数比实际的要大。为了减小误，只计数其中一半，即数上不数下，数左不数右，这样接近实际情况。

在使用细胞计数板对贴壁细胞进行计数时,需要注意哪些关键点？

1. 在打入计数板的时候不要讲液体打出压板片和计数板之间

2. 数细胞的时候只数四大块，其他地方不要数

3. 用枪吸细胞前把轻微摇动细胞

就这三点吧其他没了

用细胞计数板怎么控制细胞计数在一定范围呢

计数板本来就是用于计数细胞的，并不是用于控制细胞数量的。

如果你希望让液体中的细胞含量在某个范围，可以通过计数板计数细胞含量，然后根据计算出的细胞量大致算一下需要稀释多少，然后加生理盐水或实验需要的溶液进行稀释就可以了。当然因为计数板计数结果存在比较大的不确定性，逐渐尝试稀释。