293t细胞转染实验结果_231细胞转染
293T细胞转染失败
你做转染前的293T细胞状态如何?细胞状态不好用再好的方法、再好的转染试剂都没有用,首页要保证细胞状态OK,听我师姐说他们实验室用DEOFECT EU技术转染的大鼠293T细胞,整个转染过程都没换液,飘起来的细胞也不多
293t细胞转染实验结果_231细胞转染
293t细胞转染实验结果_231细胞转染
HEK-293T人体肾细胞系(STR鉴定)
HEK-293T细胞是293T(293tsA1609neo)细胞系(ATCC CRL-11268)的衍生物。细胞持续表达SV40抗原,该细胞常用于转染实验,转染效率较高。(转染一般以50%密度铺板,待细胞刚刚贴到皿壁上后(一般8-10小时),即可进行转染作)
2) 形态:上皮细胞样,贴壁生长
3) 含量:>1x106 个/mL
4) 污染:支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
5) 规格:T25瓶或者1mL冻存管包装
1)准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022, 添加NaHCO3 1.5g/L, D-葡萄糖2.5g/L, 丙酮酸钠 0.11g/L),90%;优质胎牛血清,10%。
2)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:90%完全培养基,10%DMSO,现用现配。液氮储存。
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
1.收到细胞后,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。
2.收到细胞先不开瓶盖,瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时(视细胞密度而定)稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时就整体外观拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,随后在显微镜下拍下细胞状态,100 ,200 各一张),观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。
3.由于细胞状态受环境、作和运输等多方面因素影响,故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态,故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后人员沟通的时间证明,期间间隔时间不能大于7天。
4.所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性,必须在二级生物安全台内作,并请注意防护,所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
293T细胞,在24孔板做转染,接多少细胞
0.5-2 X 10^5 个细胞 / 每孔
这是lipo2000说明书上给出的建议
如果你用其他的转染试剂,说明书上应该有建议的数量,不过别不会很大
293T细胞转染
血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合,从而影响转染效率。建议用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基是无血清培养基。我们实验室前段刚用RFect,siRNA方法做完A549细胞,细胞的铺板密度在45%左右,用的24孔板,每孔2ul试剂,设置的siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度,每个梯度做了2个复孔,方便比较
293细胞的siRNA转染
我们实验室现在就在使用,转染效率能达到85%以上,以下附上详细的作步骤,希望能帮到你。
A. 细胞接种:转染前一天接种细胞,每孔 500 μl 培养基(不可加抗生素),使细胞在转染时密度在30-50% 。
B. siRNA-RFect混合物准备:
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀,室温孵育5min。注意:确保在25 min内执行第三步作,不要过于延迟。
3. 孵育5min后,将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合(总体积100μl)。轻轻混匀,室温孵育20 min。
C. 将混合物加到培养的细胞内(完全培养基培养):
1. 将100μl混合物加入培养孔内,培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板,混匀。
2. 37°C培养18-72h,检测基因抑制效果。如果需要,细胞培养4-6h时可以更换培养基,但不是必须。孵育时间的长短,取决于细胞类型、
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定孵育时间。
293T细胞为什么经常用于转染、蛋白质表达?
许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40的起始位点,可以在表达SV40T抗原的细胞系中,从而提高外源基因的表达水平。293T细胞就是一种表达SV40T抗原的细胞系,它来源于人胚胎肾细胞293HEK。
经改造后在其中插入了T抗原,因此用293T细胞做转染可以获得较高的表达水平。293T细胞也可以作为普通的哺乳细胞用于筛选稳定表达的细胞系,不过它贴壁性,容易脱落,不利于筛选。3T3细胞是小鼠胚胎成纤维细胞系,它具有明显的接触抑制作用,所以易于识别已发生转化的细胞。
293细胞是人肾上皮细胞系,有多种衍生株,比如HEK293,293T/17等,来源都是人胚胎肾细胞,其极少表达细胞外配体所需的内生受体,且比较容易转染,是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系,是经过腺E1A基因的转染,能表达SV40大T抗原,含有SV40起始点与启动子区。
扩展资料:
293T细胞的转染技术:
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。
尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
参考资料来源:百度百科-T淋巴细胞
参考资料来源:百度百科-239细胞
参考资料来源:百度百科-转染
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