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荧光pcr检测原理

3 PGS指征争议

实时荧光定量PCR

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1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied Bios公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。

荧光化学物质

目前根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质不同，将其分为荧光染料和荧光探针两类。

荧光染料

荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

荧光染料的优点：

使用简便；

可以与任何PCR产物结合；

价格便宜；

荧光染料的缺点：

不能区分不同的双链DNA

引物二聚体会影响检测的敏感性

非特异性产物会影响结果的敏感性

引物二聚体和非特异性扩增问题可以通过熔解曲线 (Melting curve) 进行识别，进而通过PCR引物的设计和反应条件的优化得以解决。

总的来说，SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。

荧光探针

Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。

TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。

荧光背景低；

杂交稳定性高；

荧光光谱分辨率好；

特异性高。

TaqMan探针技术的缺点：

成本高；

设计难度大；

由于TaqMan探针的高特异性，可用于等位基因的辨别，特别适用于人类基因多态性以及根据SNP区别和定量菌株。

Real-time qPCR技术的定量原理

敏感性高；扩增曲线

在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。

荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。

在Real-time qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。

只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

荧光阈值

为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。

通常荧光阈值都是Real-time qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。

循环阈值

循环阈值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与荧光阈值有关。

一般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小物尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。

中学湘雅医学检验所的研发平台

1.目前对于基因检测主要针对一些特定的人群，因为乳腺癌有部分存在着遗传性的乳腺癌，通过血液检测观察是否有基因突变；

中学湘雅医学检验所是在中学临床理研究所和遗传理研究所的基础上发展并创建。经过周宏灏院士团队数十年的奋斗，目前已拥有“物基因组应用技术创新服务平台”等十四个及省级技术平台，能为检测所项目的顺利开展提供强大的技术支持。检验所拥有2000多平方米的专业实验室，特设临床病理室、临床免疫室、临床基因扩增检验实验室、临床生化室、临床微生物室、TDM实验室等专科实验室，并配备了先进的仪器设备。检验所严格按照颁发的《医学检测实验室基本标准》组建，具有一支先进的管理团队、专业的技术团队、经验丰富的市场销售队伍、热情诚恳的13000位点精准检测，准确率高。队伍，以及国内外的权威专家 。

基因检测都适合哪些人群？

无创的鉴定费用6000元/例，一般7个工作日出报告书。

那些人群适合做基因检测？

基因检测，通过体液、血液检测，经提取和扩增其基因信息后，通过基因芯片技术或超高通量SNP分型技术，对被检测者细胞中的DNA分子的基因信息进行检测，分析他所含有的各种疾病易感基因的情况，从而使人们能及时了解自己的基因信息，预测身体患病的风险，从而有针对性地主动改善自己的生活环境和生活习惯，预防和避免重大疾病的发生，疾病易感基因检测如同一本个人健康说明书，它告诉我们生命该如何正确使用。

有家族遗传癌症病史的人群、亚健康的人群、生活工作环境有健康影响的人群、术后康复期间的人群、关注自己身体的健康人群（基因检测科充分了解自己的身体状况）。

因此，没有表现出疾病症状只是临床没有发病而已，而基因体检可以帮助发现遗传风险，争取预防的时间，从而针对性地采取预防措施，让您的身体时刻保持在健康水平。

已患病，基因检测有没有意义？

对于已有初步症状的患病人群，基因检测可以帮助临床进行确诊，并可针对易感风险基因的携带情况，弥补易感基因造成的功能缺陷，从而进行相应治疗和预防疾病的进一步恶化。

1.婴儿做基因检测2.儿童做基因检测3.青年期做基因检测4.中年人做基因检测 5.老年人做基因检测7.化学污染、物质污染接触者或感染者做基因检测 8.肥胖NA高血糖，高血脂性功能障碍者做基因检测 9.有吸烟、饮酒习惯的人做基因检测 10、有疾病更应该做基因检测。湖南基诺蒙就是专业做基因检测的，是认可的检测机构之一哦！

基因检测适合什么样的人群：

2.基因检测适用于家族中至少有两位是女性的乳腺癌病人，还有就是家属中有乳腺癌以及卵巢癌的患者，另外就是家族中出现双侧乳腺癌或者双侧的卵巢癌，这些情况下就必须要做基因检测。

什么是PGD或者什么是移植前遗传学诊断

2、DNA亲子鉴定测试。DNA亲子鉴定是通过人体任何组织取样（例如口腔上皮细胞取样），也可以在孩子未出世前进行。该方法是目前亲子测试中最准确的一种--准确率可达99.99999％，具有精巧、简便、快速、经济、实用的特点。父子关系相对机会（RCP），按照国内外亲子鉴定的惯例，当RCP值大于99.73%时，则可以认为设父与孩子具有亲生关系。

植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)技术的发展给辅助技术(assistedreproductivetechnology,ART)带来了福音。PGD指对诊断明确的疾病如染色体疾病、单基因疾病等在胚胎植入前进行针对性诊断。单基因疾病患者或者携带者可以通过单基因疾病PGD技术,植入不携带疾病基因的胚胎;染色体异常如相互易位、罗氏易位、倒位等导致反复的患者通过染色体PGD技术,植入染色体正常或平衡的胚胎以降低风险。高龄(aancedmaternalage,AMA)、反复(recurrentspontaneousabortion,RSA)、反复植入失败(recurrentimplantationfailure,RIF)、男性因素患者因为染色体非整倍体发生率增高,学术界提倡对这部分人群进行植入前遗传学筛查(preimplantationgeneticscreening,PGS),目的是筛查23对染色体非整倍体,降低风险,提高成功几率。但因为PGS导致异常胚胎的遗弃,可能使妊娠率、活产率降低,活检过程移除细胞损伤可能影响胚胎发育潜能,活检胚胎可能需要全部胚胎冷冻而增加了冷冻复苏风险等原因,在上引起了巨大争议。目前国内并没有PGS相关指南,亟需规范。本文对PGD/PGS争议及的指征进展进行综述。

5 PGS2.0的局限性

1 PGD/PGS技术发展简史

早在上世纪70年代末期ART引起世界瞩目之时,就有学者提出通过该技术筛查异常胚胎以降低风险的设想。随后不同学者提出可通过活检极体、1~2-细胞卵裂球细胞或者几个滋养外胚层细胞进行染色体检测。1990年,英国学者进行了首例X连锁隐性遗传病PGD,卵裂球活检后通过PCR方法扩增Y染色体特异序列进行胚胎性别选择,植入女性胚胎,获得临床妊娠,开启了ART新纪元[1]。1992年双色荧光原位杂交法(fluorescentinsituhybridization,FISH)作为另一单基因疾病性别选择方案,应用X及Y染色体特异性探针进行性别选择,并且可检测X及Y染色体非整倍体[2]。1995年,基于非整倍体与女性高龄、的相关性,多色FISH-PGS登上PGD舞台[3],主要对高龄女性进行几条染色体的非整倍体筛查,开创了PGS时代,并得到了推广。但FISH技术探针数目有限,荧光PCR、全染色体染色等技术可同时进行数目较多(9~10)染色体的PGS检测,使人们有了更好的选择[4]。由于亚端粒探针的研究,相互易位PGD方法也开始发展[5],极大地降低了这部分人群的风险。各种单基因疾病的PGD方法也在这段时间进展迅速。2001年基因芯片、2002年比较基因组杂交法、2003年单细胞测序法、qPCR等全染色体筛查(comprehensivechromosomescreening,CCS)技术进入人们的视野。2004年后,基因芯片-PGS的开始增加,并于2010年后成为上大多数中心的主要PGD/PGS技术[6],单核苷酸多态(SNP)基因芯片可以快速简单地同时进行多种单基因疾病PGD,并同时可行23对染色体非整倍体筛查[7]。近年来,高通量测序技术可能成为最有潜力PGD/PGS技术。

2 PGS不同指征提出

PGD/PGS指征始终与分子遗传技术发展相适应。虽然PGD/PGS发展时间较短,但在PGD/PGS领域各种新的分子生物学技术临床转化速度非常快,目前PGD/PGS已成为ART技术的重要组成部分,极大地改变了ART面貌,使ART技术从单纯解决不孕不育问题转为成为优化妊娠结局的有利技术,并有可能对所有ART人群应用。1990年,PGD

工作组(InternationalWorkingGrouponpreimplantationgenetics)成立,其工作是对全球PGD的工作进行总结和指导。1997年,欧洲人类与胚胎学会(ESHRE)PGD工作组成立,提出对高危人群进行PGS以提高,并且每年进行数据统计以跟进PGD进展。2002年PGD学组(PGDIS)成立,并于2004年发表了PGD技术指南[8],该指南首次结合ART中心建立指南及PCR/FISH实验指南对PGD的各个环节给出指导意见,为建立高效有序的PGD中心提供了性指导方案,但是对PGD/PGS指征未给出明确的指导意见。2005年,ESHRE的PGD工作组在PGDIS指南的基础上进一步给出了PGD/PGS纳入指征指南,更具有实用性[9]。指征分为建议纳入及不建议纳入两类。PGD建议纳入诊断明确的、致畸或致残性且遗传可能性大(染色体重排可能性>10%;单基因遗传比例25%~50%)的单基因疾病;易位型染色体问题;HLA配型且已有干细胞治疗手段的疾病列入遗传相关指征。PGS建议纳入RSA>2次,每个中心可依地区、规定自行决定次数;RIF>3次移植高级别胚胎失败;或者多次移植累计达10个胚胎失败;AMA>36周岁。但是任何可能因卵巢、卵泡穿刺、妊娠而产生并发症风险高的女性都建议不进行ART,生育力低下如AMA女性(40~45岁以上年龄)、基础FSH值>15IU/L、体质量指数>30kg/m2及其他不适合进行ART的疾病均不建议纳入,具体来说,窦卵泡数(AFC)数目<7个,胚胎质量不考虑。这一版本指南没有将男性因素不育作为PGS指征,是否将男性因素不育列为PGS指征争议较大。2006年,上还是倾向将男性因素不育作为PGS指征[10],并在多中心实践,主要原因为男性因素可导致胚胎染色体异常几率升高[11]:胚胎原发性染色体异常如三体、单体几率及性染色体异常几率增加;梗阻性与非梗阻性无症患者胚胎PGS结果显示非整倍体率均高于50%[12];少弱症患者的与对照相比非整倍体率显著升高[13];卵泡质内单注射(intracytoplaicsperminjection,ICSI)/获取(testicularspermextraction,TESE)-PGS后妊娠结局明显改善[14];补救ICSI后胚胎染色体异常高发,进行活检及PGS可有效地改善妊娠结局[15-16];男性年龄是否与胚胎非整倍体发生相关尚无定论,但一项基于胚胎的研究表明高龄男性(>50岁,于女性年龄因素)囊胚形成率降低,胚胎非整倍体发生率显著增高[17]。男性因素对胚胎的影响仍需进一步研究,是否需要将补救ICSI及高龄男性纳入PGS尚无定论。

RSA、RIF、AMA、男性因素四指征也是目前进行PGS的主要医学指征。PGS一开始的设想为降低因染色体异常带来的植入失败、、引产及出生缺陷风险,高龄是女性妊娠结局较的因素之一,也是提出的PGS指征,但一部分ART中心实践后显示,PGS可能减少了部分染色体异常的风险,但并未改善妊娠结局,而且降低了活产率。有2篇重要的针对AMA女性PGS效果的前瞻性队列研究均显示[18-19],与对照组相比,PGS组可移植胚胎数目明显降低,持续妊娠率明显降低,活产率明显降低。这2篇文章一经发表便引起巨大争议,也动摇了对PGS的信心,直接导致2007年后PGS周期数的直转急下[20]。与此同时,针对RSA、RIF、男性因素指征进行的随机病例对照或者回顾性分析均不支持PGS有提高妊娠率的效果[21-23]。

虽然PGS不断,但大多数学者仍然认为PGS对妊娠结局有正面影响,主要集中在以下几个方面:①虽然活产率无明显提高,但率、多胎率有明显下降;②AMA女性PGS极大地降低了唐氏综合征发生风险,>40岁高龄女性PGS更为经济[24];③PGS可减少高龄女性因反复造成的情感创伤,并降低中孕期风险;④部分人群还是可见明显的妊娠结局改善。

由于2007年前大多数ART-PGS使用卵裂球细胞活检+有限染色体FISH技术(PGS#1),大多数学者认为可能该技术的局限导致了PGS临床效果的异。卵裂球活检有较高的局限性:①可能对胚胎发育潜能影响较大;②可能因活检或者固定过程导致细胞核碎裂、溶解致结果不准确;③早期胚胎嵌合体多发,卵裂球结果可能错误率较高。极体活检FISH-PGS后持续妊娠率提高,也从另一方面提示可能卵裂球活检对胚胎发育潜能的影响。而FISH技术局限性也很多:①FISH信号的解读困难;②FISH探针不能覆盖全部染色体;③不同指征人群可能产生非整倍体机制不同,导致FISH-PGS结果异[25]。对Mastenbroek等[26]发表在新英格兰杂志上的结果进行深入分析后,部分学者认为该团队经验不足,可能活检技术、细胞固定技术、FISH技术、FISH报告错误、患者选择偏倚造成最终结论不准确。基于卵裂球活检及FISH技术的局限性,开始提倡改变活检方式,同时进行CCS,终止FISH-PGS[27-28]。

4 PGS2.0的提出

PGS#2(2.0)与FISH-PGS(PGS#1)区别:①第5/第6日(D5/D6)囊胚滋养外胚层活检或极体活检,不再采用第3日(D3)卵裂球活检;②采用基因芯片或者其他技术进行CCS,弃用FISH技术[29-30]。2010年ESHRE的PGD工作组呼吁评估PGS2.0临床效果[31],得到许多支持,随后CCS有利于ART妊娠结局的呈爆发式增长:卵裂球活检+比较基因组杂交基因芯片(aCGH)显著提高妊娠率,降低多胎妊娠及率[32];aCGH准确性较FISH提高,且植入率、妊娠率提高[33];time-lapsemonitoring结合aCGH-PGS较单纯PGS显著提高妊娠率[34-35];CCS结合囊胚移植显著提高了妊娠率、持续妊娠率、活产率,降低了率[36],且多胎风险降低;AMA(40~43岁女性)、RSA人群临床效果也令人满意[37-38]。美国2011—2012年PGS大数据分析显示>37岁女性PGS后每周期活产率及每移植周期活产率较对照组显著提高[39];一些小型前瞻性研究显示[40],CCS显著提高预后较女性的植入率与妊娠率。

PGS2.0主要指征同2005年ESHRE的PGD工作组发布指征,但增加了男性因素:常规检查异常;基因组衰

减(spermgenomedecay,SGD),包括染色体碎片化增加,染色质分散,非整倍体率增加等。这些男性可通过ICSI生育,但胚胎发生异常几率可能增高,应加入PGS指征。具体为:①指标异常需要ICSI助孕进行PGS[减少(<5×106/mL);梗阻性或非梗阻性无精];②经皮TESE-ICSI。次要指征有:前次偶发染色体非整倍体;胚胎质量较;选择性单胚胎移植。

2015年,一些IVF中心不加选择对所有IVF患者进行PGS显著提高了妊娠率[41],开始了是否对所有IVF患者进行PGS的争论。鉴于高通量测序技术的快速发展及利用胚胎培养液游离DNA的无创PGS的提出[42],未来有可能实现对所有胚胎进行损伤小但快速准确的染色体筛查。

虽然目前PGS2.0是选择胚胎、改善妊娠结局的一种较好的方法,其局限性也显而易见:①活检可能带来胚胎损伤、植入潜能下降、表观遗传变化及成年后可能的远期影响,亟需开发损伤更小甚至无创的检测方法以降低可能的影响;②目前PGS结果分析所需的时间超过24h,需要胚胎冷冻以选择合适时机移植,虽然现有研究显示新鲜胚胎和冷冻胚胎具有相似的妊娠结局[43],然而胚胎冷冻对胚胎发育的安全隐患一直是辅助领域研究的焦点和热点,随着技术不断发展,缩短PGS出报告的时间,PGS2.0后新鲜囊胚的移植可能成为未来努力的方向;③现有PGS2.0检测技术都是基于全基因组扩增后的胚胎细胞DNA进行的分析,其分析的准确性有赖于扩增产物完整性,然而扩增偏倚无法消除,可能带来阳性与阴性,故目前定义的PGS仅是对非整倍体进行筛查,随着技术进步,是否可以扩大PGS的筛查范围,增加小片段重复缺失的筛查?④PGS2.0仍然无法预知嵌合体胚胎的结局,且PGS2.0对嵌合体的识别度可能较高,由于嵌合体胚胎可能发育成正常个体,也可能,嵌合体在所有早期异常核型中占比约2.88%[44],故难以界定嵌合体胚胎的妊娠结局,对嵌合体胚胎的移植前咨询成为目前难点,需要进一步研究。

6 PGS2.0展望

PGS目前争论焦点已从PGS是否对临床有利转而讨论扩大PGS指征的必要性。虽然目前仍缺乏多中心前瞻性随机对照研究证据的支持[45],仍需要重新认识和评估PGS,不可否认的是2010年后上大多数ART中心已将囊胚活检+PGS(PGS2.0)+FET作为常规手段运用于主要指征人群(AMA、RIF、RSA、男性因素),主要目的在于降低该人群风险,提高,且显示较好的效果,对PGS的认同已全面恢复。PGS2.0已极大地改变了ART面

貌,可能成为未来中心对所有患者的一个常规项目。

为什么有户口还上不了幼儿班

当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

没有户口是不能上的，以后也不能上学。可以找医院补办出生证明。申请做亲子鉴定，也可以直接上户口的。

目前DNA亲子鉴定的收费标准大概为3口人以下3500-5000元/例，一般两周后即可得到鉴定结果，如果有特殊需要，3天也可以得到鉴定结论。

亲子鉴定的方法：

1、传统的亲子鉴定是进行血型测试。一般孩子6个月以上才可以做，并需要大量的血液样本。这种方法过程烦琐、取样痛苦且错误率高。传统的血型判断在一定程度上有其作用,但亲子鉴定并不能按照血型来鉴定。

3、SNP检测。当前DNA亲子鉴定利用人类基因组中的重复碱基序列(STR作为第二代分子标记)和PCR技术进行个体识别，但STR具有很大的局限性，SNP是第三代分子标记技术是将来的发展方向，美国1尸体辨认即利用了此技术。

亲子鉴定的费用和所需时间:

无创DNA亲子鉴定的流程是怎样的

只能用于检测产物长度低于150bp的反应。

无创的DNA亲子鉴定孕7周后一直到分娩前都可以做亲子鉴定。

首先鉴定委托协议、了解注意事项后便可以采集样本了 取样也是无创的，只需要采集10通常情况下，人不是突然从健康到疾病的，这是一个连续的过程，而且病变在体内也是需积累到一定程度才表现出症状。毫升静脉血，对胎儿和孕妇没有任何伤害。

脱氧核糖是干什么用的？

脱氧核糖（DNA）是TaqMan探针技术的优点：正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。生物细胞内携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息的一种，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。

DNA的主要功能是长期性的信息储存，它的序列构成遗传指令，生物遗传、生物发育与生命机能运作。这些指令以“基因”的形式存在于细胞内，并指导着细胞内的蛋白质合成。每个基因都携带着特定的遗传信息，这些信息决定着某种蛋白质的合成，如血红蛋白、胰岛素等。

此外，DNA的保证了遗传信息的稳定性和连续性，为细胞的分裂和增殖提供了的模板。

一分钟了解脱氧核糖