酶切位点序列 ecorv酶切位点序列

如何用dnaman软件设计引物及找到引物上的酶切位点

参数说明如下：

1）PCR 引物设计

酶切位点序列 ecorv酶切位点序列

酶切位点序列 ecorv酶切位点序列

首先，将目标 DNA 片段装入 Channel,并激活 Channel。点击主菜单栏中的 Primer 主菜

单，出现下

拉菜单，如下所示：

点击 Design PCR Primers for DNA 命令，出现下列对话框： 参数说明如下：

Primer locations on target 引物定位

其中包括下列选项：

Product size（扩增目的片段大小）

Sense primer (正向引物选择区)

Antisense primer(反向引物选择区)

Primer 引物特性包括 Length(引物长度)，Tm 值, GC 含量等参数；

Reject primer 引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）

包括下列选项：

3’dimer(可形成 3’端自我互补的碱基数)

Hairpin stem(可形成发卡颈环结构的碱基数)PolyN(多聚碱基)

3’Uique(3’端严格配对碱基数)

Consentrations 浓度设定

Product for hybridyzat（ion） PCR 产物用于 Southern Blot 探针杂交

点击按钮，出现下列对话框：

.选择需要的选项，点击按钮，出现：

2）DNA 序列的限制性酶切位点分析

将待分析的序列装入 Channel，点击要分析的 Channel，然后通过 Restriction/Analysis

命令打开对

话框，如下所示：

Results 分析结果显示

Show summary（显示概要） Show sites on sequence（在结果中显示酶切位点）

Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶

切模式图）

Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）

Ignore enzymes with less t现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。han（忽略小于某设定值的酶切位点）

Target DNA （目标 DNA 特性）

circular（环型 DNA），dam/dcm mylation（dam/dcm 甲基化）

分析，如果

选择了 Draw restriction pattern，那么当所有的 channel 有两条 DNA 时，则只能选择两个酶

选择所需的项目，然后按提示作点击按扭，出现下列对话框：

代表（enzyme data file），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，restrict.enz 和

dnamane.enz，

如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。其中 restrict.enz 数据文件包

含 180 种

限制酶，dnamane.enz 数据文件包含 2524 种限制酶。选择其中一个数据文件，相应的

酶在左边的

显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白

出。要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如 puc18 multiple

cloning sites），

输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切

位点。

Cutter 酶切识别序列长度；End 酶切产生的末端，其中包括，Blunt（平头末端），

5’Overhang

（5’突出粘性末端）,3’Overhang同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。(3’突出粘性末端)，系统根据 cutter 和 end 的设定情

况,在左边酶列表

中显示符合条件的酶。，点击按钮执行作。

PCR过程，引物,酶切位点的问题

框中列分析，如果共有三个Primer-Primer(含义未知)以上 DNA 时，则只能用一个酶分析。

PCR引物设计怎么做 啊？跪求！

Enzyme

让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：

① 引物应用系列保守区内设计并具有特异性。

② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑧ 引物5′端可以修饰。

⑨ 引物3′端不可修饰。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值接近72℃以使复性条件。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物之间

两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的设计好引物后，分别在上下游引物的5’端加上你所需要引入的酶切位点就可以了。如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。如果不做PCR产物酶切而是直接连接T载体，就可以不加保护碱基，PCR结束后直接加A连T,然后按流程作就可以了。一般是需要转化-验证-测序，如果是构建表达载体的话还有酶切、连接、验证。认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。

现有的引物设计软件有primer5.0比较好。

引物设计时如何添加酶切位点

正向合成时延伸到反向引物结合位点时就会停止，同理反向引物也是。I：G/AATTC

DNA合成，新链的延伸方向是5→3 因此，需要在5端加上酶切位点记得再加上一些保护碱基，因为内切酶除了有特异的识别位点之外， 还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来 保护碱基的具体数目一般5-6个。 引物的结构就应该是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列

然后点击按钮出现下列对话框：

产生限平末端的限制酶切点怎么表示

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

例如碱基序列是-CTATAG-，形成的平口末端是CTA-，平口末端相同，属于同一种限制酶切割。一般的限制性酶切位点都是回文序列，所以只要写其中一条的5’-3’端序列，中间以斜杠隔开，算是酶切点就好。

使用软件,primer你试试,能自动分析出你提供的序列的所有的酶切位点

EcoR

限制⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。酶切位点是指DNA上可供限制酶切割的磷酸二酯键，如果已经切开，便不再是酶切位点了，而是粘性末端或平末端。两条链加在一起算一个切点。

限制酶切割位点是基因工程中的构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶，限制酶会识别限制酶切割位点(即某个DNA序列，如AACC--TTGG，当然，不同的限制酶作用位点不一)，限制酶能将磷酸二酯键切断，不是随便切断，而是特定的。

出下列序列中可能包含的酶切位点，并写出识别序列。 TCCCCCGGGAAGCGAATTCAAGC？

1.引物的不是随意首先，这个问题存在逻辑颠倒的毛病。添加.酶切位点都加在引物的5‘端.这样在轮扩增后,就会产生有酶切位点的产物了(酶切位点在产物的两端）.在接下来的扩增中每个产物就都会有了.PCR的时候可以耐受引物的5‘端由数个不匹配的碱基对.但是随着扩增的进行,产物都有这些位点后,就不存在不匹配的问题了特异性

引物分为正向引物和反向引物吗？各自的作用是什么？？？

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

正向引物和反向引物是相对的，通常以一个双链DNA（上面的那条链）的上游结合部位称为正向引物，是从左到右的方向，也就是5-3的方向，而下面那条互补链的下游结合部位称为反向引物。

其方向是从右到左的，因为下面的链的方面从左到右是3-5，从右到左就是5-3了，PCR的扩增的确是一条引物就可以扩增了。

扩展资料：

因为在同一PCR反应中，是用一个退火温度的，为了保证目的片段两端的引物都能与模板配对互搭，所以在设计引物时点击按钮，完成作。，尽量使两个引物的Tm值不要别太大。

一般引物长度为15~30碱基糜蛋白酶： Phe Trp Tyr酸羧基端内切胰蛋白酶：Arg Tyr酸羧基端内切弹性蛋白酶：小R基氨基酸羧基端内切氨肽酶：氨基端外切羧肽酶：羧基端外切常用的就是这些，还有一些，你可以自己找本生化书看看，扩增片段长度为100~600碱基对。 一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布随机。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。

还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

引物加酶切位点的原理

其中all DNA in Sequence Channe反向引物的存在可以结合互补链，使互补链的扩增方向也是5-3，这样一次就是两条链同时扩增，循环一次就是4条链同时扩增再循环一次就是8条链同时扩增，这样才是所谓的几何级数扩增。l（选择此项，在 Sequence Channel 中的所有序列将被包括：

如何确定酶切位点

All matches(引物互补配对百分数)

如果人为加的话是设计引物时候加的，加在引物的5‘端。另外基因上本来也存在一些酶切位点，这种的不需要人工加了。

你好

很高参考资料⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。来源：兴为你解答

载体构建酶切位点的问题

3.长度

酶切位2.避开产物的二级结构区点的选择一定是要避开目标片段比如，例子：内包含的位点，因为如果不避开到时候酶切就会把目的片段切开。在目的片段和载体之间的酶切位点都是扩增引物带入的。