提质粒的目的是什么？酶切的目的是什么？

提质粒的目的：去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

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酶切的目的：对粘末端的DNA分子和载体分子进行切割，以获得相应的粘末端连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切，单酶切作比较简单，双酶切困难。

扩展资料

质粒提取的实验原理

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的异来分离它们。

在pH值介于12.0～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确。

它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

参考资料来源：

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提取质粒作为运载体，运载体必须具备以下条件：

1.能够在宿主细胞内并稳定保存；

2.具有多个限制酶的切点，以便与不同的外来基因链接；

3.具有某些标记基因，便于进行筛选。

>>常用的运载体有：质粒、噬菌体、灭活的动植物等；而质粒为最常用的运载体。

酶切的目的即为了获得目的基因。

一般提质粒是为了保存 因为质粒比菌株容易保存

而酶切的目的有很多 有的是为了做连接 有的是为了检验目的基因是否连接上，有的是为了获得粘性末端等

提质粒拿来当载体，酶切是为了连接

质粒提取的基本原理

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

实验原理

提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。

碱裂解法

人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

煮沸法

煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。

质粒小提试剂盒

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

传统方法与试剂盒提取质粒哪些步骤不同,试剂盒改进的这些步骤，提取原理是什么？

传统方法与试剂盒提取质粒的主要不同在于样品破碎、裂解和纯化的步骤。传统方法通常需要通过机械破碎、处理或化学方法（如碱裂解）等手段来打开细胞并释放DNA，然后通过离心、柱层析等手段进行纯化。而试剂盒则通常采用了改进的化学方法，将上述步骤集成在一起，简化了过程，同时也提高了提取DNA的纯度和产率。

试剂盒提取质粒的基本步骤包括：细胞破碎/溶解，去除杂质，结合DNA到载体，洗涤，再溶解，最终获得高纯度的质粒DNA。其中，试剂盒改进的步骤主要包括以下几个方面：

细胞破碎/溶解：试剂盒中通常包含有专门的细胞破碎/溶解缓冲液，可以快速有效地破坏细胞膜和细胞壁，释放出DNA。

去除杂质：试剂盒中会添加一些化学试剂，例如盐和碱性成分等，用于去除细胞杂质和蛋白质等。去除杂质的过程可以通过离心或柱层析来实现。

结合DNA到载体：试剂盒中多数采用硅胶或玻璃纤维膜等固定相材料，通过将DNA在其表面吸附并结合，来提高提取的纯度和产量。

洗涤：经过固定相的DNA需要洗涤以去除非特异性结合的物质，例如残留的碱基、盐、蛋白质、RNA等。洗涤步骤可以使用高盐缓冲液和等试剂进行多次反复洗涤。

再溶解：，DNA/载体复合物会被释放到恰当的缓冲液中，使其中的DNA易于储存和使用。

试剂盒提取质粒的原理是利用化学方法将质粒DNA从细菌细胞中裂解和收集到纯化介质中，同时去除其它或杂质。其中，细胞裂解试剂包含了一些快速有效的细胞破碎/溶解缓冲液，可以迅速地打开细胞并释放DNA。而纯化过程中，固定相材料可以选择性地吸附DNA，并去除非特异性的杂质。经过多次洗涤和溶解后，最终获得高质量、高产量和高纯度的质粒DNA。

碱裂解法提取质粒dna的原理是什么？

其基本原理为：

当菌体在NaOH 和SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后， 质粒 DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

相关介绍：

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb 至200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、于细胞染色体之外的自主的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的而，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

纯化质粒DNA 的方法通常是利用了质粒DNA 相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA， 经过、抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

大提质粒原理

大提质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。

碱裂解法原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

煮沸法裂解：将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。

小量一步提取法：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快，仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢，会形成不溶的网状结构，通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

抽提质粒的基本原理是什么

现在的质粒抽提一般是利用碱裂解法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的异达到分离目的。

高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。