单酶切连接的问题？

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。

1确认连接体系没有问题。2

xbai酶切位点序列 xbai酶切位点序列与保护碱基xbai酶切位点序列 xbai酶切位点序列与保护碱基


xbai酶切位点序列 xbai酶切位点序列与保护碱基


考虑PCR产物回收产物浓度提高一点。连T一般很容易的，我也正向引物和反向引物是相对的，通常以一个双链DNA（上面的那条链）的上游结合部位称为正向引物，是从左到右的确认设计引物的时候两边酶切位点的碱基和保护碱基没有问题。3方向，也就是5-3的方向，而下面那条互补链的下游结合部位称为反向引物。做的单酶切连接，祝成功啦。

如何将20个100bp插入质粒

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。

如果你限定是十几bp其实比较难进行，因为这个片段上下游必须是某一个或两个酶切位点。但如果只是想去掉包含了这部分片段的片段，那就比较好办啦，这段片段上下游很大的范围内有酶切位点就行了。然后要插上目的片段的话，只要目的片段两端插入了相应的酶切位点，这样质粒和目的片段很多情况下不能，在测序时用你的引物进行测序的，读取的数据是你引物后的序列，引物序列不能被读取，所以不包含引物序列，要想有引物序列信息，需要将PCR产物克隆进载体，用载体上的引物测序。就可以在连接酶的作用下形成重组质粒了。而酶切位点的插入，只需在克隆片段的时候引物的5‘端加上相应的酶切位点序列就好了。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

pUC克隆载体相邻酶切位点PstI,SalI,XbaI酶切效率如何?

④ G+C含量在40%~60%之间。

先用PstI酶切,参数说明如下：再用SalI酶切,酶切效果

先用SalI酶切,再同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。用PstI酶切,酶切效果较好

用PstI和SalI分步酶切：酶切效果

bamh1酶切位点是什么

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值接近72℃以使复性条件。

在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。 无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T载就不必考虑了）。先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI.

1.我的连接体系是10微升，加1微升缓冲液，1微升T载体，7微升我的pcr产物，还有1微升的酶，T载体和pcr产物浓度比为1比7-10左右，都做过，可是挑出的单菌落都是自连了。2.我的酶切位点是XbaI，两端加的保护碱基是GC，根据保护位点的要求加上去的3.浓一点的话载体和产物浓度比大约是多少请详细的说下你做过的单酶切可以么，想知道我的问题到底出在哪里，非常感谢！

BamHI是一种限制性内切酶，识别位点G^GATCC。在分子克隆实验如果添加过自制的酶列表,则附加显示自制酶列表文件名.其中restrict.enz 数据文件包含180 种中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T载就不必考虑了）。先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。

常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。 下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。

先介绍一下什么是II型内切酶，The Type II restriction s typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and clee at constant itions at or close to that se

DNAman 怎么分析序列的酶切位点

10.密码子的简并

Results 分析结果显示

其中包括：

Show summary（显示概要） Show5.碱基础随机分布 sites on sequence（在结果中显示酶切位点）

Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶切模式图）

Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）

Ignore enzymes with less than（忽略小于某设定值的酶切位点）

circular（环型DNA）,dam/dcm mylation（dam/dcm 甲基化）

Enzyme

代表（enzyme data file）,点击旁边的下拉按钮,出现两个默认选项,restrict.enz 和dnamane.enz,

限制酶,dnamane.enz 数据文件包bamh1酶切位点如下：含2524 种限制酶.选择其中一个数据文件,相应的酶在左边的 显示框中列出（按酶名称字母表顺序）,鼠标双击酶名称,则对应的酶被选中,在右边空白框中列 出.要自制酶切列表,可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如puc18 multiple cloning sites）,然后点击按钮出现下列对话框：输入要保存酶列表的文件名,点击按钮即可保存.自制酶列表可以方便分析特定的酶切位点.

氨基酸序列转为核苷酸序列，如何引入多种限制性酶切位点？

将待分析的序列装入Channel,点击要分析的Channel,然后通过Restriction/Analysis 命令打开对话框.

A、限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割，A正确；

B、限制酶有多种，只有EcoR I的识别序列是GAATTC，B错误；

C、限制酶切割能引物中四种碱基的分布是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。产生黏性末端，但限制酶不能识别黏性末端，C错误；

D、限制酶能识别特定的核苷酸序列，并PCR引物设计原理:在特定的位点进行切割，因此不一定会切割质粒DNA的标记基因，D错误．

用pcr产物测的序列片段，一定能够在里面找到引物序列吗？

Target DNA （目引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。标DNA 特性）

测序是读不出引物的，而且引物后的几十个碱基都读不好。想测出引物，或者克隆，或者再设计引物。

如果是用上下游引物做的PCR，产物中就有引物序列，但有的测序恭喜测序时会把引物序列去掉，只保留目的基因的序列，只要你的测序的目的基因的比对正确，应该就可以认为未突变

如果是扩增已知序列目的全长基因，肯定是要在基因序列外部设计引物，当然接下来还有克隆表达等作，在引物设计时考虑增加酶切位点以及添加序列标签等。如果是扩故选：A．增未知序列基因，一般要根据序列比对找到保守序列，设计兼并引物，扩增产物一般是目的基因的部分序列，还要通过3"、5‘race以及染色体步移等作得到全长序列。

正向引物和反向引物的区别？

临床实验室

其方向是从右到左的，因为下面的链的方面从左到右是3-5，从右到左就是5-3了，PCR的扩增的确是一条引物就可以扩增了。

反向引物的存在可以结合互补链，使互补链的扩增方向也是5-3，这样一次就是两条链同时扩增，循环一次就是4条链同时扩增再循环一次就是8条链同时扩增，这样才是所谓的几何级数扩增。

扩展资料：

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

因为在同一PCR反应中，是用一个引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。退火温度的，为了保证目的片段两端的引物都能与模板配对互搭，所以在设计引物时，尽量使两个引物的Tm值不要别太大。

一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布随机。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。

还需提醒的是3′端不要终止于密⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

参考资料来源：

参考资料来源：

参考资料来源：

保护碱基加一侧还是两侧

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两侧，在各个酶的两边加上保护碱基。 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。但实验证明，大多数限制酶对的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR 引物时，为保护5`端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。

PCR引物的设计原则：添加保护碱基的原则

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数Tags: 酶切位点, 酶切位点表, 酶识别序列, BamHI酶切位点, EcoRI酶切位点, HindIII酶切位点, NdeI酶切位点, Xho酶切位点I目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。