单细胞rna测序 单细胞RNA测序方法

【单细胞测序数据分析-1】认识Seurat对象数据结构/数据格式及作

单细胞转录组测序 基因表达量分析 需要多少测序量

一文了解单细胞对象数据结构/数据格式，单细胞数据作不迷茫。本文内容包括 单细胞seurat对象数据结构， 内容构成，对象的调用、为了提高复杂度，即一次能够捕获的单细胞数目，目前的解决方案是走组合索引（combinatorial indexing）路线。（见下图，来自文献doi:10.1038/nm.4154）作，常见函数的应用等。

单细胞rna测序 单细胞RNA测序方法

单细胞rna测序 单细胞RNA测序方法

默认情况下，我们是对Seurat中的RNA的Assay进行作。可以通过 @active.assay 查看当前默认的assay，通过 DefaultAssay() 更改当前的默认assay。

结构

counts 存储原始数据，是稀疏矩阵

data存储logNormalize() 规范化的data。总表达式对每个单元格的要素表达式度量进行标准化，将其乘以比例因子（默认为10,000），并对结果进行对数转换

scale.data#存储 ScaleData()缩放后的data，此步骤需要时间久。

降维后的每个细胞的坐标信息，包括pca，tsne，umap等

2. 由于barcode的存在，CITE-seq检出的mRNA+蛋白是可以对应的，可就是说是可以同时得到每个细胞的mRNA+蛋白表达量。无别

返回的数据类型不同

pbmc[['nCount_RNA']] 取出来,是所有细胞的nCount_RNA，包含细胞信息，数据框

无别

之前写了对seurat对象的主要 作列表 ，这里不赘述。下面主要看数据作。

参考教程

技术 | 单细胞转录组测序之Microwell-seq

15、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors

Microwell-seq 是 浙江大学郭国冀等人 一篇Cell( )中提出的一种较为cost-efficient的scRNA-seq。该文公布了哺乳动物（小鼠）细胞图谱。

Microwell-seq的特点是使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）提供了高分辨率分析基因表达和构建复杂器官或生物体发育图谱的机会。最近，10x Genomics scRNA-seq平台已被广泛用于鉴定拟南芥根中的细胞类型或结构域标记（Rich Griffinetal.，2020），但该技术在茎组织中的应用还受到限制。单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状态的研究，以得到更完善的基因表达的信息。一种特殊的琼脂糖微孔板，即Microwell作为单细胞捕获的平台。

Microwell的制备如上图所示，其本质是转录因子（TF）的直接调控靶点在相同的细胞类型同表达，使用scRNA-seq数据来计算KN1与其公布的直接调控的靶点的共表达，发现与所有玉米基因的对照相比，其显著高于预期。KN1直接调控的转录靶点在单细胞表达水平上与KN1显著共表达，支持原来的设。KN1在除了表皮和侧器官中表达量均较高，而通过scRNA的数据发现ZmHDZIV8在3，6这两个聚类中大量表达，同时侧器官中的Marker基因ZmYAB4在聚类3中表达，因此明确了两个细胞类别。为了验证，接下来作者整合了两个额外的ChIP-seq数据集，用于ZmHOMEODOMAIN亮氨酸拉链IV6（ZmHDZIV6）（Jelle 等人，2011年）和ZmMADS16（ZmM16）（Bartlett等人，2015年）在特定花器官中表达。对于每一个TF在 Chip-seq的生物学重复中均有显著重叠，作者确定了ZMMADZIV6和ZmM16的907个高置信度峰，并对这两个基因的motif进行进一步的研究。由刻有约10万个小孔的硅片作为载体，再在其上包裹上PDMS和Agarose而成。从图中可以看到，单细胞加样到Microwell后会落入芯片的小孔中，一个小孔只能容纳单个细胞与一个磁珠（其protocol指出一般只有10%的小孔既有细胞又有beads）。图中有黑点的孔就是有细胞loading上的，每一个小孔相当于一个的反应腔，之后的细胞裂解，磁珠吸附作都会在此完成。如此就保证了一个磁珠上的RNA只来源于一个细胞。

Microwell-seq 建库流程如上图所示，基本包括：

Microwell-seq的barcode也是利用一种 UMI 的方法区分不同细胞来源的mRNA。对mRNA的富集是通过oligo(dT)实现的，所以会有3' bias

Microwell-seq 是由华人科学家开发的一种单细胞测序技术，有高通量、低成本和测序质量高的特点。Microwell给我的感觉与Iontorrent的sequencing chips很相像。Iontorrent的chips是通过将beads加到一个个小孔中测序，以此辨别每个beads上的测序信号。而Microwell则是将单细胞和beads加入小孔中进行反应，本质上小孔都是提供一种反应腔的功能，保证各个小孔的信号不会互相干扰。这也是单细胞分离的要点，即准确记出RNA的细胞来源。

以上就是我对Microwell-seq一点粗略的见解。

CITE-seq：同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序

文章研究了12525个来自玉米穗发育的单个细胞的转录谱。由此产生的发育图谱提供了花序的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱。并通过mRNA原位杂交和荧光活化细胞分类（FACS）RNA序列验证了我们的结果，并通过预测遗传冗余、整合转录网络和鉴定与作物产量性状相关的候选基因，进一步展示了这些数据如何促进遗传研究。

单细胞测序方法和原理系列：

CITE-seq这个方法在2017年的时候发表在nature mods上。作者还建了一个网站：

ADT (antibody derived tags) 概念：被测序测到的“从抗体衍生出来的标签”的数量。可以近似地认为， ADT就是抗体所对应的蛋白在一个细胞上的表达量 。但要注意的是，这里只是一个近似值，因为不同抗体对抗原的亲和力是不一样的。

CITE-seq由mRNA测序和对带标签的抗体测序组成。单细胞测序的部分和10X的原理是一样的，参考： 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics 。只是CITE-seq在原有单细胞测序的基础上加了抗体，抗体可以结合到细胞表面相应的蛋白上，抗体上带有特殊的DNA标签。

带有DNA标签的抗体：

抗体的设计使得它1）能够被基于寡聚dT建库的RNA文库所捕获；2）含有用于区分抗体条形码序列；3）能够进行后续的PCR特异扩增。

使用链霉素-生物素亲和反应将抗体与寡核苷酸的5’端连接起来，同时还包含了一个二硫键，于是在还原条件下寡核苷酸便能够从抗体上释放出来。

首先将抗体和单细胞悬液一起孵育（和流式类似），抗体和细胞结合后洗去未结合的抗体，随后样本即可对接10x技术被分成油包水小液滴。

细胞裂解后，mRNA和与抗体结合的寡核苷酸通过它们3’端的polyA尾巴，同时与含有polyT的微珠发生退火而结合在一起。在反转录时，与微珠结合的一段特殊的条形码序列能够区分来自于不同细胞的mRNA和为了对 CellTrek 的性能进行基准测试，利用了三个空间数据集，1) 具有自定义空间模式的模拟 scRNA-seq 数据集与抗体结合的寡核苷酸序列。而扩增了的来源于抗体的序列（ADTs）和cDNA分子能够通过大小区分开，并将其构建为的Illumina测序文库。

需要注意的是，两个文库类型是可以同时进行测序的，但考虑到测序深度问题，由于它们是单独构建的，因此可以将它们合并在单一泳道中并调整它们的相对比例，以确保每个文库都能获得适当的测序深度。

文完。库制备好之后就可以进行测序了

1. 同时测mRNA+蛋白信息，数据更丰富，对细胞的注释更准确，有助于发现新的细胞类型。

3. 与流式细胞相比，CITE-seq又可以不受抗体之间信号干扰的影响，大大增加了表面蛋白标记的数量(一次可以检出多达100个的蛋白)，从而可以一次性获得多种由抗体蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果关注点在细胞蛋白上，ADTs可以于细胞的mRNA而单独测序、分析，即已报到的Abseq。

参考：

Total-seq的前世今生——前世：CITE-seq

10X单细胞空间联合分析之十一（CellTrek）

总体而言，若针对冻存样本、细胞直径大于40um以及相对较难解离的植物样本，建议采用SnRNA-seq；一些较难解离的动物样本，派森诺的单细胞研发团队可提供一对一个性化的解离方案，让科学研究多一种选择。某些具体情况，则要根据研究目的进行个性化地调整。例如，关注肝癌样本中的肝实质细胞，SnRNA-seq是更佳的方案；关注肝癌样本中的免疫细胞，ScRNA-seq是更加方案。若关注肝癌样本中的肝实质细胞和免疫细胞，则可联系您身边的派森诺销售，让派森诺的资深技术支持，提供个性化的实验方案。

单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 方法可以分析单细胞的转录组，但不能保留空间信息。 相反，空间转录组学 (ST) 分析可以描绘组织切片中的空间区域，但没有单细胞基因组分辨率。 在这里，作者开发了一种称为 CellTrek 的计算方法，它结合了这两个数据集来实现单细胞空间映射。 测试使用模拟研究和两个原位数据集对 CellTrek 进行了基准测试。 然后，应用 CellTrek 从正常小鼠大脑和肾组织的现有数据集中重建细胞空间结构。 分析还对两个导管原位癌 (DCIS) 组织进行了 scRNA-seq 和 ST 实验，并应用 CellTrek 来识别仅限于不同导管的肿瘤亚克隆，以及与肿瘤区域相邻的特定 T 细胞状态。 数据表明，CellTrek 可以准确地绘制不同组织类型中的单个细胞，以解析它们的空间组织。

6、Cells of the human heart

在这里，作者开发了 CellTrek，这是一种计算工具包，可以根据 scRNA-seq 和 ST 数据将单个细胞直接映射回组织切片中的空间坐标。 这种方法提供了一种不同于 ST 反卷积的新模式，能够更灵活、更直接地研究具有空间地形的单细胞数据。 CellTrek 工具包还提供了两个下游分析模块，包括用于 空间共定位分析 的 SColoc 和用于空间 共表达分析 的 SCoexp。 使用模拟和原位数据集对 CellTrek 进行了基准测试。 然后，将 CellTrek 应用于来自正常小鼠大脑和肾组织的现有数据集以及从两个人类导管原位癌 (DCIS) 样本生成的数据，以研究单细胞空间分辨率下细胞类型/状态的组织。

CellTrek 首先将 ST 和 scRNA-seq 数据集成并共嵌入到共享特征空间中

CellTrek 使用 ST 数据训练multivariate random forests (RF) model，以使用共享降维特征预测空间坐标。 引入了对 ST 数据的空间非线性插值以增加空间分辨率。 然后将训练后的模型应用于共嵌入数据以导出 RF 距离矩阵，该矩阵测量 ST spot和由空间坐标监督的单个细胞之间的表达相似性。 基于 RF 距离矩阵，CellTrek 在阈值化后使用相互最近邻 (MNN) 生成稀疏spot细胞图。 ，CellTrek 从相邻spot传输细胞的空间坐标。 为了提高兼容性，CellTrek 可以接受从其他方法（例如 novoSpaRc）计算的任何细胞位置概率/距离矩阵作为细胞空间图表的输入。 此外，提供了一个图形用户界面 (GUI)，用于对结果 CellTrek map进行交互式可视化。

为了概括不同细胞类型之间的空间关系，开发了一个下游计算模块 SColoc，它将 CellTrek 结果汇总为图形抽象

提供了三种方法，即 Kullback-Leibler 散度 (KL)、Delaunay 三角测量 (DT) 和 K-最近邻距离 (KD)，用于计算细胞类型之间的空间异。 基于相异度矩阵，SColoc 可以构造一个最小生成树 (MST)，表示简化的空间细胞邻近度。 上述步骤将在样本上迭代执行以生成共识矩阵（在异或 MST 上）。 此后，图形将通过具有可调边缘阈值和颜色映射功能的 GUI 呈现。 此外，SColoc 提供了一个 Kdistance 度量，用于测量细胞到选定参考组的空间距离。

为了研究不同的表达程序是否分布在不同的地形区域，作者开发了 SCoexp，它利用 CellTrek 坐标来检测目标细胞内的共表达基因模块。

首先，SCoexp 根据它们的空间距离计算空间核权重矩阵。 使用这个权重矩阵，SCoexp 计算空间加权基因共表达矩阵。 此后，SCoexp 利用共识聚类 (CC) 或加权相关网络分析 (WGCNA) 来识别基因模块。 对于识别的模块，我们可以计算模块分数并investigate它们的空间组织。

生成了三个相应的 ST 数据集，每个spot聚合了五个空间最近的细胞

将 CellTrek 应用于 scRNA-seq 和 ST 数据以重建它们的空间细胞图。 然后，将CellTrek 与另外两种细胞制图方法进行了比较：1) NVSP-CellTrek，它使用基于参考的 novoSpaRc（一种空间重建方法）来计算细胞空间概率矩阵，然后利用 CellTrek 生成空间图，以及 2) Seurat coordinate transfer (SrtCT) which uses the data transfer approach to transfer ST coordinates to single cells。 CellTrek 和 NVSP-CellTrek 都重建了模拟数据的原始空间格局，而 SrtCT 只重建了细胞之间的粗略空间关系，不能准确地映射细胞

与 NVSP-CellTrek 相比，CellTrek 以更高的空间密度绘制了更多的细胞。 为了定量评估这些方法，我们使用 KL 散度将细胞绘图结果的空间密度与不同细胞类型的原始空间分布进行了比较。 CellTrek 和 NVSPCellTrek 均以低 KL 散度实现了良好的性能，而 SrtCT 与参考分布的异要大得多

在果蝇胚胎数据中，CellTrek 准确重建了原始空间布局，三种方法中 KLdivergences

在 CellTrek 结果中进一步研究了几种已知的果蝇胚胎发生基因，并发现了与先前研究一致的空间模式

在小鼠胚胎数据中，我们发现 CellTrek 和 NVSP-CellTrek 准确地重建了原始空间结构，而 CellTrek 在第 5、9 和 17 组中显示出略高的 KL-divergences

为了研究 CellTrek 是否可以揭示小鼠胚胎发育的空间模式，我们选择了一组肠管细胞，发现一些标记基因与之前的研究存在空间一致性

接下来评估了 CellTrek 在三种不同模拟设置下对模拟数据的性能：1)read counts，2) 空间随机性，以及 3) 组织密度。 我们使用 KL 散度和 Pearson 相关性在 CellTrek 地图和参考之间的细胞空间坐标上评估 CellTrek 性能。 在三个模拟中（每个模拟有八个条件），与置换测试相比，CellTrek 实现了良好的空间重建性能，并显示出更低的 KL 散度和更高的相关性。 然而，增加空间随机性会影响 CellTrek 的性能并降低统计显著性，同时减少read counts或spot/cell密度将导致稀疏的细胞图。 总体而言，该数据表明 CellTrek 是一种在不同实验条件下进行单细胞空间映射的稳健方法。

将 CellTrek 应用于公共小鼠大脑 scRNA-seq (Smart-seq2)和 ST 数据集（Visium，10X Genomics）。 我们将 CellTrek 与 NVSP-CellTrek 和 SrtCT 方法进行了比较。 CellTrek 按照 L2/3 端脑内 (IT)、L4、L5 IT、L6 IT、L6 皮质丘脑 (CT) 和 L6b 的顺序重建了层流兴奋性神经元亚型的清晰层结构，与大脑皮层结构相匹配。 NVSP-CellTrek 显示出类似的空间层趋势，从而证明了 CellTrek 方法的灵活性和一致性。 然而，NVSP-CellTrek 在某些区域导致了稀疏的细胞映射。 SrtCT 未能准确地将细胞位置投影到组织学图像上。 然后我们使用 Seurat 标签转移 (SrtLT) 来预测每种细胞类型的空间分布作为我们的参考。 细胞制图结果与参考文献之间的 KL 散度表明 CellTrek 成功地恢复了空间细胞结构，并且在三种方法中具有的 KL 散度

接下来，验证 CellTrek 是否可以进一步揭示同一细胞类型内细胞状态的拓扑模式。 例如，L5 IT 细胞包含五种表达状态，并在 UMAP 上以 Hsd11b1-Endou、Whrn-Tox2、Batf3、Col6a1-Fezf2 和 Col27a1 的顺序显示出连续趋势。 L5 IT CellTrek map发现了一个精炼的子层架构，这与之前的研究一致。 为了总结细胞空间共定位，我们使用基于 KL 的 MST 共识图将 SColoc 应用于 CellTrek 结果。 谷氨酸能神经元细胞类型按层结构的顺序构建了图形的线性主干。 到 L2/3 IT 细胞的空间 K 距离在图表的相同顺序中显示出显著增加的趋势（Spearman's rho = 0.，P < 2.2e-16）

然后，使用 SCoexp 研究了基因如何在 L5 IT 细胞中空间共表达。 鉴定了两个共表达模块（K1、K2）并显示出不同的生物学功能富集。 K1 模块在细胞状态 Hsd11b1-Endou、Whrn-Tox2 中高度活跃并在空间上位于外层，而 K2 模块在 Col27a1、Col6a1-Fezf2 和 Batf3 中高度活跃，主要位于内层。 这些结果表明 SCoexp 能够识别相同细胞类型内的细微转录异并推断它们的拓扑异质性。

还将 CellTrek 应用于来自小鼠海马体的 Slide-seq v230 和 scRNA-seq 数据 。 Slide-seq 数据的无监督聚类确定了 12 个具有高度组织空间结构的聚类 (G01-G12)。 CellTrek 将单个细胞映射到它们的空间位置，这与 Slide-seq 集群一致。 值得注意的是，G06 与 Cornu Ammonis (CA) 区域匹配，而 CellTrek 揭示了 CA1、CA2 和 CA3 主细胞的顺序映射，这些主细胞无法单独通过 Slide-seq 聚类解决。 这些结果表明 CellTrek 可以广泛应用于不同的空间基因组平台，以实现更精细的空间细胞分辨率。

接下来使用 SColoc 总结了一个细胞空间图。 ProxTub 细胞被确定为枢纽并连接到 RenaCorp、DistTub 和其他细胞类型。共识热图和层次聚类显示出与图抽象相似的模式。由于 scRNA-seq 数据是从小鼠肾的不同区域显微解剖中收集的，我们询问 CellTrek 是否可以在没有先验知识的情况下重述实验区域信息。根据 CellTrek 结果，我们计算了 TLLH、DistTub 和 Prin 细胞到中心区域的一组细胞的 K 距离。观察到一致的趋势是 Kdistances 从皮质到外髓质，然后到内髓质，这表明 CellTrek 成功揭示了小鼠肾的带状结构。此外，在 DistTub 细胞中，我们使用 SCoexp 确定了两个不同的空间共表达模块（K1 和 K2）。 K1 模块富含代谢途径、肾系统发育，并与一些远曲小管 (DCT) 基因高度相关。相比之下，K2 富含细胞基质途径、嘌呤代谢途径，并与远端直管 (DST) 经典基因相关。这两个模块在 UMAP 和 CellTrek 地图上显示了不同的模式。 K1在皮质区高度活跃，而K2在髓质区活跃，这与DCT和DST的解剖定位一致

进一步query CellTrek 是否可以通过利用空间信息来提高我们对细胞间通讯的理解。 我们使用 CellChat 对 scRNA-seq 数据进行了细胞-细胞相互作用分析，并使用 SColoc 图通过设共定位的细胞将有更高的机会相互作用来过滤细胞-细胞对。 与原始 CellChat 结果相比，预测了所有细胞类型之间的许多非特异性相互作用，空间过滤提供了一组更简洁、更具体的减少的相互作用。 重要的是，分析确定了之前过的几种相互作用，包括 ProxTub 表达的 Vegfa 与其受体 Flt1 和 Kdr 相互作用，后者由 Vasc 表达

将 3' scRNA-seq（10X 基因组学）和 ST（Visium，10X 基因组学）应用于 DCIS 样本 (DCIS1)，以分析 6,828 个单细胞和 1,567 个 ST spot。 对于 scRNA-seq 数据，聚类和异表达 (DE) 分析确定了 5 种主要细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓细胞和自然杀伤 (NK)/T 细胞

应用 CopyKAT 从 scRNA-seq 数据推断拷贝数分布。在所有肿瘤细胞中观察到一些克隆拷贝数改变 (CNA)，包括染色体 3q (PIK3CA)、8q (MYC) 和 19p (STK11) 的增加以及染色体 8p (PPP2R2A)、10q (PTEN) 和 14q 的丢失。 AKT1)。 CNA 谱的 UMAP 和 dbscan 聚类确定了三个主要肿瘤亚克隆 (clone1-3) 具有一些不同的改变，包括克隆 2 和克隆 3 中的 17q (ERBB2) 增益和 11q (ATM) 丢失，克隆 2 中的 1q（MDM4 和 EPHX1）增益和克隆 3 中的 6q (FOXO3) 丢失。基于共有的 CNA 谱，我们构建了一个系统发育树，显示克隆 1 是较早的亚克隆，与主要谱系不同，其次是克隆 2 和克隆 3。值得注意的是，这三个亚克隆表现出转录异质性。 Hallmark 基因集富集分析确定了所有三个亚克隆的几种常见途径，包括 MYC 靶标、酸化和 DNA 修复。我们还确定了亚克隆特异性特征，包括富含克隆 2 和克隆 3 的雌激素反应途径，以及富含克隆 2 的干扰素 α/γ 反应、凝血和补体途径。

为了了解三个肿瘤亚克隆的空间分布，我们将 CellTrek 应用于 scRNA-seq 和 ST 数据。大多数肿瘤细胞映射到 H&E 载玻片上的 DCIS 区域。此外，不同的肿瘤亚克隆映射到不同的导管区域，反映了广泛的肿瘤内空间异质性。具体而言，clone2 主要位于中间 (M) 导管，而 clone3 主要位于右侧 (R) 导管，而 clone1 分布在许多导管区域。 ST 肿瘤spot的无监督聚类确定了五个 ST cluster，它们显示空间和基因表达与肿瘤 CellTrek 图一致。基于每个导管的亚克隆组成，我们进行了聚类分析并计算了香农指数，产生了四个具有不同亚克隆组成和空间模式的主要导管簇。总体而言，来自组织右侧部分的导管显示出较低的克隆多样性，而来自中间和左侧区域的一些导管显示出较高的克隆多样性

使用 SCoexp 进一步研究了肿瘤细胞的空间共表达模式，并确定了三个基因模块（K1、K2 和 K3）。 K1 模块在 Clone1 中含量较高，并富含肌动蛋白相关通路。 CellTrek 显示具有高 K1 分数的细胞在空间上对应于肿瘤克隆 1。 相比之下，K2 在 Clone2 和 Clone3 中含量较高，并且富含对雌二醇、乳腺导管形态发生和一些分解代谢过程的反应。 有趣的是，K3 模块在增殖肿瘤细胞方面非常活跃，并且与细胞周期相关过程有关。 K3 评分的空间映射显示增殖的肿瘤细胞主要位于几个导管的外围区域附近。 总之，这些数据表明 CellTrek 工具包可以描绘不同肿瘤亚克隆的拓扑图及其在 DCIS 组织中的表达程序。

在另一个具有同步侵入性成分 (DCIS2) 的 DCIS 样本中，我们分析了 3,748 个单细胞（10X Genomics）和 2,063 个 ST spot（Visium，10X Ge2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；nomics）。 无监督聚类和 DE 分析确定了 10 个簇，包括三个上皮簇、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、髓细胞、NK/T、B 和浆细胞样树突细胞 (pDC)。 CopyKAT 揭示了一个带有 CNA 的非整倍体上皮Cluster（上皮 3）

接下来，发现一些 T 细胞靠近肿瘤区域，一些位于肿瘤区域的远端。我们进一步分析了 T 细胞并将它们重新聚集成六种细胞状态，包括幼稚 T (NaiveT)、CD4+ T (CD4T)、CD8+ T (CD8T)、调节性 T 细胞 (Treg)、耗竭 CD4+ T (CD4Te) 和耗尽的 CD8+ T (CD8Te) 。研究了这些 T 细胞状态在 CellTrek 图中的分布。值得注意的是，Tregs、CD4Te 和 CD8Te 细胞大多靠近肿瘤细胞。进一步构建了 T 细胞内的空间图，发现来自相同谱系的细胞倾向于在空间上共定位。计算了 T 耗竭分数，发现耗竭分数高的 T 细胞倾向于定位在肿瘤区域附近。 T 细胞与其最近的 15 个肿瘤细胞的 K 距离显示出与 UMAP 上的 T 耗竭评分相反的趋势。正如预期的那样，与非抑制性 T 细胞相比，免疫抑制性 T 细胞（Treg、CD4Te 和 CD8Te）具有更高的耗竭评分。根据 K 距离将 T 细胞二值化为肿瘤远端 (TD) 和肿瘤近端 (TP) 组，发现 TP 组显示出明显高于 TD 组的耗竭评分（P = 1.1e-4），表明存在DCIS 导管区域附近的免疫抑制微环境。还发现了类似的趋势，其中 TP 与 TD 相比，CD4T 和 Treg 细胞的耗竭分数更高，而 NaiveT 细胞的趋势相反。重要的是，TD 组只包含很少的免疫抑制性 T 细胞，这与发现一致，即耗尽的 T 细胞倾向于共定位在 DCIS 区域附近。

髓细胞的重新聚类确定了四种细胞状态，包括常规树突状细胞 (cDC)、单核细胞和两种巨噬细胞亚群（Macro1 和 Macro2）。CellTrek 将大部分 cDC 投影到肿瘤近端区域。空间图显示 Macro2 细胞与Macro1和cDC共定位。然后我们计算了骨髓细胞到肿瘤细胞的K-距离，发现cDCs总体上显示出的K-距离，而Macro1细胞具有更高的K-距离。K-距离密度 图显示了类似的趋势。我们进一步检查了 Macro1 细胞的空间共表达，并使用 SCoexp 确定了两个主要基因模块（K1、K2）和一个次要模块。K1 模块在来自肿瘤远端区域的巨噬细胞中更活跃，并且相关 具有多个 C1Q 基因、HAVCR2、CD74、HLA-DRA 等。相反，K2 模块显示出相反的空间模式并与 CHIT1、CSTB、APOC1、MARCO 等相关

为了正交验证 CellTrek 推断的肿瘤和免疫细胞的空间分布，我们对来自 DCIS2 和另一个 DCIS 样本 (DCIS3) 的组织切片的靶向探针进行了免疫荧光 (RNAscope) 实验。该数据表明，DCIS 肿瘤细胞区域具有 ERBB2 的高表达，而 TAGLN 标记了导管的基底上皮层。此外，免疫抑制性 T 细胞标志物，包括 CTLA4 和 FOXP3，在 DCIS2 的 DCIS 区域附近具有高表达，这与 CellTrek 结果一致。同样，在 DCIS3 中，我们在导管附近发现了具有 CTLA4 和 FOXP3 的免疫抑制性 T 细胞。此外，该数据显示 B 细胞 (MS4A1)、单核细胞/巨噬细胞 (CD68) 和树突状细胞 (CD1C) 也在 DCIS 导管区域附近，表明存在 TLS，并且与 DCIS2 的 CellTrek 结果一致。相比之下，在同一组织切片的正常小叶上皮区域中观察到的免疫细胞较少，尤其是免疫抑制性 T 细胞标志物。这些数据证实了我们对使用 CellTrek 推断的 DCIS 肿瘤免疫微环境的发现。

在这里，作者开发了一种新的计算工具 CellTrek，用于基于 scRNA-seq 和 ST 数据重建空间细胞图。与传统的去卷积方法相比，CellTrek 提供了一种新范式，可以将单个细胞直接投影到组织切片中的空间坐标，从而充分利用 scRNA-seq 数据。我们还开发了两个下游计算模块（SColoc 和 SCoexp）来进一步分析 CellTrek 结果。通过重建蜂窝空间图，CellTrek 提供了几个优势。首先，它提供了一种灵活的方法来以空间方式研究单个细胞的任何特征（例如，细胞类型/状态、伪时间），而大多数 ST 解卷积方法只能将SPOT分解为细胞类型，无法实现单细胞级特征映射.其次，CellTrek 非常灵活，可以将任何细胞位置概率/相似性矩阵作为输入来重建细胞图，从而实现进一步的下游分析。第三，通过利用度量学习方法和非线性插值，CellTrek 允许以更高的空间分辨率进行更准确的细胞绘图。，随着更高空间分辨率测序技术的发展，CellTrek 完全能够将单个细胞绘制到其他空间测序数据，以提供更高的空间粒度。

首先使用模拟和原位数据集对 CellTrek 性能进行基准测试，然后评估不同数据条件下的准确性和稳健性。 通过将 CellTrek 工具包应用于来自小鼠大脑和肾的两个“完善”的数据集，我们展示了其恢复不同细胞类型拓扑结构的能力。 进一步表明，CellTrek 可以通过将分类（即细胞状态）和连续特征（即伪时间）映射到组织切片来识别高分辨率子结构。 SColoc 还可以将不同细胞类型的空间关系重建为图形，可进一步用于细胞间通讯分析。 此外，SCoexp 可以检测多种细胞类型内的空间共表达模块，显示组织切片中的拓扑模式。

在研究中，我们对两个 DCIS 样本进行了匹配的 scRNA-seq 和 ST 实验，并应用 CellTrek 工具包来描绘不同导管区域中肿瘤亚克隆的空间分布和肿瘤免疫微环境的拓扑组织。 在 DCIS1 中，我们发现三个肿瘤亚克隆定位于具有不同克隆多样性水平的不同导管。 尽管先前已经观察到形态学和基因组肿瘤内异质性，但在这里我们报告了 DCIS 组织中导管网络内的空间异质性。 在 DCIS2 中，CellTrek 准确映射了肿瘤

单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？

一、什么是单细胞测序？

如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。

目前，测序可以回答以下6类问题：

1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；

3. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有异的。当然了，这个异可大可小。

4. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；

5. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；

单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。

二、为什么要使用单细胞测序？

如果把这个问题换个姿势来问，那就变成，为什么非用单细胞测序不可？

又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在异的。而这种异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。

这就是所谓的 遗传信息的异质由于核膜稳定性比细胞膜高，因此组织冻存后细胞核膜不会被破坏，因此 冻存组织可以提核做SnRNA-seq ，提高了单细胞测序的样本类型和实验设计丰富度。性 。

传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。为了让大家能够更加直观地理解这个问题，我们不妨来看下面这张图：

为了检测某个蛋白质的表达量，我们可以用Western blot和流式细胞术来实现。但是，用Western blot的话，我们并没有办法区分上述的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？因为最终电泳跑出来，就是一条不多强度的带。但如果用流式细胞术这种在单细胞水平对荧光强度加以测定的技术，就能区分上述的情况了。

同样道理，单细胞测序能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。而这将带领整个遗传学领域进入新的次元。

三、如何实现单细胞测序？

目前主要有两种策略来实现单细胞测序。

种，也就是目前大多数人所想象的那样，将单个细胞分离出来，并构建测序文库，最终进行测序的路线。我们可以通过流式细胞术（含微流体芯片），或者激光捕获显微切割（LCM）来实现。流式细胞术估计大家比较熟悉，就不多讲了，它主要运用于细胞样品。对于组织切片样品来说，主要是通过LCM来获取单细胞，原理可以见下面的示意图。

不过，将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。通常做十几二十来个细胞，就要烧掉很多钱了。然而，这数十个细胞，就足够说明问题了吗？

为了克服这个困难，近年来多采取第二种策略：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

基因转座是指转座子DNA从一个染色体座位“跳跃”到另外一个座位的过程。在这个过程中，有转座酶的参与。单细胞的DNA测序就利用了这个特性，将barcode DNA预先和转座酶Tn5组装好，再通过上述的微流体技术，将细胞和转座复合物包裹在一个油滴之中。随后，转座酶会把barcode插入到基因组DNA之中。这个过程在文献中也被成为tagmentation。

不过，基于Tn5的barcode复杂度（即能有多少的barcode）还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，上图中红色的barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别（如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode），barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。具体就不展开讲了。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。

它的主要思路是，通过两步反应，加两次标签。首先，将单细胞悬液放在多孔板中，并用转座酶Tn5给细胞加个barcode，这里每个孔中的barcode是不同的。然后，再将样品混合起来，通过流式细胞术，将少量的细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中。而这些引物是带有第二轮barcode的。因此，经过Tn5的转座，和PCR加标签，绝大部分的细胞就能带上的barcode了。

读到这里，肯定有人发现这个方案存在的问题。举个例子，万一在流式分选时，在个孔里分了两个或以上橙色细胞，然后又通过PCR被加上了红色的标签，那这两个单细胞就无法被区分开来了。

确实如此，combinatorial indexing大概会有10%的撞车率（collision rate），即约有10%的机会把两个单细胞被误认为是同一个。这个数值的高低，取决于步tagmentation的复杂度（复杂度越高，撞车率越低），以及在分选时，分到每一个孔里的细胞数量（数量越低，撞车率越低）。但是，combinatorial indexing却能一次识别数千个单细胞，将通量提升数十至上百倍。鱼与熊掌，就看实验者的取舍了。

he染色10x是什么意思？

He染色10x是一种高通量基因测序技术，其主要用于研究基因组或转录组中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。其原理是将单个细胞的RNA放置于微流控芯片中，利用酶进行逆转录合成cDNA，然后利用特定的DNA测序方法对其进行测序。在这个过程中，He染色10x可以同时处理大量的单细胞RNA，因此可以在相对较短的时间内对成千上万个单细胞RNA进行分析。

He染色10x技术的应用在医学领域中植物植株是由多能干细胞及其后代发育的分生组织发育而来的。分生组织能够分化为不同的细胞类型和具有特定功能的结构。在玉米穗发育过程中，部分分生组织形成花序结构。扮演着重要的角色。通过该技术，医学研究人员可以更好地理解不同疾病的分子机制，并且对疾病的诊断和治疗提供更具有准确性的指导。例如，在研究肿瘤细胞的过程中，He染色10x技术可以帮助研究人员识别具有特殊转录调节模式的细胞，这将为定制有效的治疗方案提供指导。

He染色10x技术已经成为生物学各个领域中有用的工具。例如，在植物学领域中，转录组学的研究对象包括mRNA和非编码RNA等。新一代高通量测序技术可以全面快速地获得特定细胞或组织在某一个状态下几乎所有转录本的序列信息和表达信息，从而准确地分析基因表达异、基因结构变异、筛选分子标记（SNPs或SSR）等生命科学的重要问题。该技术可以帮助研究人员对单个细胞进行了解，如花粉管头发的分子机制，以及水稻鲍氏黑条矮缩的传播机制。与传统方法相比，He染色10x技术的高通量和高灵敏度，使得其可以更好的对生物样本进行分析和检测。

单细胞测序和单细胞核测序的区别

He染色10x技术的使用有助于高通量测序的单细胞基因组，其已经成为基因组学及其相关科学中的一个重要研究领域。其应用可以判断不同细胞中某一基因的转录水平以及对分子的表达，有助于研究人员更深入地了解转录机制。同时，He染色10x技术还可以用于研究单个细胞的表观基因调控。

生物体正常的生理功能依赖于复杂的细胞及分子通过复杂的网络相互作用推进和完成，生物体的复杂程度在细胞类型、细胞比例、细胞的空间位置、细胞的基因表达、细胞间的通讯互作、染色质的状态、基因的序列等众度实现精准调控。单细胞测序作为新出现的强有力工具，正是解析细胞网络的合适技术手段，它通过一次性对数以万计的细胞进行检测，绘制出组织或器官的细胞图谱，明确细胞间的调控模式和状态变化，为解析生命机制提供细胞层次分辨率的系统见解。随着对科学研究的不断深入，单细胞测序（ScRNA-seq）的帝国包含了单细胞转录组测序，空间转录组测序、单细胞ATAC测序和单细胞免疫组等几个重量级产品，在不同水平揭示了组织内部的异质性。近期，有越来越多的研究者关注了单细胞核测序（SnRNA-seq）。相较于ScRNA-seq的针对单个细胞进行测序，SnRNA-seq制备单细胞核悬液，针对单个细胞核进行测序和分析。今天，我为大家详细比较以下两者的优劣势，看看两者更适用于怎样的研究场景。

将 CellTrek 应用于公共小鼠肾数据 32 并将其与 NVSP-CellTrek 和 SrtCT 进行比较。 CellTrek 使用位于不同组织学区域（例如，皮质、外髓质和内髓质）的不同细胞类型准确重建了细胞空间结构。与 CellTrek 相比，NVSP-CellTrek 显示出相似的空间模式，而 SrtCT 无法重建小鼠肾细胞的准确空间组织。使用 SrtLT 作为参考，CellTrek 和 NVSP-CellTrek 都实现了整体低 KL 散度，NVSP-CellTrek 显示出更高的 VSMC 和 RenaCorp 细胞的 KL 散度。 SrtCT 显示与参考分布的 KL 散度。为了进一步研究空间细胞表达动态，我们分别推断了 ProxTub 和 DistTub 细胞的轨迹，并基于 CellTrek 对它们的伪时间进行了空间映射。对于 ProxTub 细胞，我们观察到从皮层外部到内部的连续空间轨迹。 ProxTub 细胞的这种连续解剖变化与之前的研究一致。同样，DistTub 细胞也显示出具有清晰空间模式的连续轨迹。总的来说，这些结果表明 CellTrek 可以解决组织中单细胞连续表达程序的拓扑排列。

影响ScRNA-seq结果的关键因素是单细胞悬液的质量，ScRNA-seq对细胞悬液的质量要求非常高（细胞数量、活性、浓度、背景干扰等），因此细胞悬液的制备只适用于新鲜组织或者冻存后复苏组织（主要是前者），这限制了ScRNA-seq的应用范围，意味着保存在超低温冰箱中、具有重要科研和临床价值的大量珍贵样本无法进行scRNA测序。

众所周知，解离过程中不同类型细胞在解离效率上存在异，与免疫细胞相比，成纤维细胞和内皮细胞更多嵌于细胞外基质和基底膜中，因此更难以分解【2】；同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎，因此解离过程大概率无法有效的获取到组织中的所有细胞类型，导致结果的准确性大为降低。

基于以上列出的ScRNA-seq的局限性，SnRNA-seq开始在一些研究中被广泛应用，以脑组织单细胞转录组研究为例，目前大多数文章更倾向于实用SnRNA-seq，包括神经细胞【3-5】、心【6、7】、肾【8、9】、肝【10、11】、脂肪【12、13】等。

已经有大量文献证明，SnRNA-seq能够解决ScRNA-seq中存在的主要问题，其优势主要体现如下：

直接冻存状态下对细胞进行机械破碎或者化学破碎，不会再出现酶解法引入的解离偏好性，相对而言细胞回收的全面性更高。通过比较分析了肾组织利用dropseq和10x两种平台的ScRNA-seq和SnRNA-seq的区别，发现SnRNA-seq的结果中包含了很多在scRNA中不存在的细胞类型，肾小球足细胞的比例增加了20倍【14】。

虽然SnRNA-seq相比较ScRNA-seq具有多方面的优势，但同样S不过，针对具体的测序类型，给细胞加barcode的方案是有不小的区别的。对于RNA（转录组mRNA）来说，会比较容易理解一些。由于mRNA测序前需要做逆转录，那么我们只需要在poly T引物的5’端加入barcode即可。具体可见下面的示意图（来自文献doi:10.1038/nprot.2016.154）：nRNA-seq的劣势也比较明显：

SnRNA-seq只能检测细胞核中的mRNA, 缺失对细胞质中的mRNA分子的检测。同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用SnRNA-seq每个细胞核中检测到的基因会偏少，不利于细胞亚型的鉴定。

虽然上文提到SnRNA-seq可以提高细胞检测的全面性，但是其在某些细胞类型的再现上并没有优势。2020年发表在Nature Medicine的一篇文章【15】，对不同肿瘤类型的新鲜/冷冻样本进行ScRNA-seq和SnRNA-seq， 结果显示两种方法检测到的细胞类型相似，但比例别较大：在神经母细胞瘤中， 相比SnRNA-seq，ScRNA-Seq中免疫细胞比例更高，神经嵴、神经内分泌细胞等实质细胞大幅减少；而SnRNA-Seq结果中实质性细胞（尤其是恶性细胞）比例更高，但是T细胞大幅减少，B细胞和NK细胞基本消失，内皮细胞、上皮细胞增加。

参考文献：

1、Defining cell types and states with single-cell genomics

2、Single-cell sequencing rals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations

3、A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain

4、Alzheimer's Patient Microglia Exhibit Enhanced Aging and Unique Transcriptional Activation

5、A Spatiomolecular Map of the Striatum

7、Transcriptional heterogeneity of fibroblasts is a hallmark of the aging heart

8、A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys

9、Complementary Roles for Single-Nucleus and Single-Cell RNA Sequencing in Kidney Disease Research

10、Single-Nuclei RNA Sequencing Assesent of the Hepatic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin

11、Characterizing the Heterogeneity of Liver Cell Populations Under a NASH-Related Hepatotoxicant Using Single-Nuclei RNA Sequencing

12、Plasticity of Epididymal Adie Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution

14、Aantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Raled in Fibrosis

单细胞测序 rna-seq 哪个更准

6. 其他魔性应用：比如DNA损首先将单细胞悬液样品和带有barcode的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。的barcode了（蓝色部分）。，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。

单细胞测序和RNA-seq是应用在不同研究中的两种测序类型，只看适不适合，没有那个更准的问题，单细胞测序主要应用在细胞分化、发生、发展、演化过程中的突变等，如癌症的组织异性，干细胞的分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络等，单细胞测序也有全基因组测序和转录组测序两种；RNA-seq主要用于组织或器官等RNA的表达情况，如功能基因的表达上调及下调分析，转录因子的表达水平等。

单细胞测序应用及思路解析

教程中，pbmc[['percent.MT']]向meta.data添加 percent.MT 这一列。

单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种高通量、高分辨率的分子生物学技术，可以对单个细胞进行基因组、转录组、表观组等方面的测序，从而深入地了解单个细胞的特性。单细胞测序技术已经在生物医学、生态学、农业等领域得到广泛应用。下面将介绍单细胞测序的应用及思路解析。

疾病研究：单细胞测序可以帮助研究人员深入了解疾病的发病机制和诊断标志物，并为新研发提供关键信息。

生物发育研究：单细胞测序可以揭示生物个体从单细胞到多细胞群体的发育过程，以及不同细胞类型之间的相互作用。

生态学研究：单细胞测序可以研究微生物群落的特点和结构，以因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。及它们在生态系统中的作用和相互作用。

农业研究：单细胞测序可以研究作4. CITE-seq能够与10X Genomics无缝衔接，方便易作。物的基因型和表型，以及不同生长阶段的生长特点和代谢过程。

二、思路解析

单细胞测序的思路可以分为以下几个步骤：

单细胞分离：单细胞测序需要首先将样本中的单个细胞分离出来，可以通过流式细胞分选、微流控芯片等技术实现。

细胞裂解：将单个细胞进行裂解，释放其中的RNA、DNA等分子。

库构建：将RNA、DNA等分子进行逆转录、扩增、建库等处理，构建出单细胞的转录组或基因组文库。

测序：将构建好的文库进行高通量测序，产生大量的序列数据。

数据分析：对测序数据进行分析，包括数据质量控制、比对、拼接、注释等步骤，得到单个细胞的基因型、表型、代谢过程、信号通路等信息。

总之，单细胞测序技术是一种高效、高分辨率的分子生物学技术，可以帮助研究人员深入了解单个细胞的特性，为生物医学、生态学、农业等领域的研究提供关键信息。

SCmut||分析单细胞数据突变

元数据，对每个细胞的描述。一般的meta.data包括orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA, 以及计算后的percent.mt，RNA_snn_res.0.5等

单细胞RNA测序(scRNA-seq)和DNA测序(scDNA-seq)都可以应用于细胞水平基因组分析。对于突变分析，scDNA-seq似乎更常见。然而，这项任务是非常具有挑战性的，只有两份拷贝DNA分子作为输入十分有限，而全基因组扩增则会产生偏和其他技术噪音。scRNA-seq通常具有更大的数据量和更好的数据质量。但目前DNA测序中检测突变的方法多种多样，尚不清楚这些方法是否可以用于scRNA-seq数据。

对Bulk RNAseq或scDNA-seq数据开发的突变检测方法不适用于scRNA-seq数据，因为它们会产生过多的阳性。因此，作者开发了一种新一、应用的、稳健的统计方法——称为SCmut，来识别特定的突变细胞。他们将SCmut应用于几个scRNA-seq数据集。在scRNA-seq乳腺癌数据集中，SCmut可以识别许多高度可信的细胞水平突变，这些突变在许多细胞中都反复出现，并且在不同样品中保持一致。在scRNA-seq胶质母细胞瘤数据集中，发现PDGFRA基因中的复发性细胞水平突变与该基因中众所周知的框内缺失高度相关。

简而言之，该方法首先从肿瘤和匹配的种系组织的大细胞DNA测序（bcDNA-seq）中收集体细胞突变。然后，结合从scRNA-seq中提取的单个细胞的single-nucleotide variants （SNV），SCmut使用二维局部错误发现率（2D local fdr）方法在细胞水平上统计检测体细胞突变。将该方法应用于（i）两名乳腺癌患者的几个scRNA-seq数据集，（ii）乳腺癌细胞系MDA-MB-231的两组细胞，以及（iii）胶质母细胞瘤细胞的一组。在（i）中，发现的细胞水平突变在肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间被很好地分开，在（ii）中，突变被同时在两个的数据集中发现。在胶质母细胞瘤数据集（ii单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 方法极大地扩展了我们对不同细胞类型的基因表达程序及其在发育和疾病中的作用的理解。然而，scRNA-seq 在组织解离步骤中固有地丢失了细胞空间信息， 这对于理解细胞微环境和细胞间相互作用至关重要 。虽然空间测序方法，包括空间转录组学 (ST) 和 Slide-seq，可以在空间上描绘跨组织切片的基因表达，但它们仅限于测量具有细胞混合物的小区域，并且不能轻易提供单细胞信息。为了解决这个问题，已经设计了计算方法（例如， cell2location 、 RCTD ）来将 ST spot解卷积为不同细胞类型的比例。然而，空间去卷积方法仅限于推断每个spot的细胞类型比例，无法实现单细胞分辨率。此外，去卷积方法将细胞类型进一步解析为反映不同生物学功能的更细粒度的“细胞状态”（表达程序）的能力有限。 ，大多数反卷积方法只能预测分类标签，而不能以空间分辨率推断连续的细胞信息（例如，谱系轨迹、基因特征、连续表型） 。i）中，我们发现了与PDGFRA基因中众所周知的24 bp读框内缺失高度相关的细胞水平突变。

单细胞转录组测序 基因表达量分析 需要多少测序量

pbmc[[]]，中括号取的是上面结构图中的二级数据名称

基因表达谱测序是直接对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，可以用来研究基因的表达异情况。该技术结合了转录组测序建库的实验方法，与转录组测序相比，基因表达谱测序要求的读长更短，测序通量更小，但仅可用于基因表达异的研究。

转录组测序是RNA水平测序，相当于DNA水平的基因组测序，是一个框架。表达谱主要研究的是基因表达量的变化，上调或下降。先要有转录组或是基因组才可以做表达谱，否则没有Ref做参考。

转录组测序和表达谱测序其实都是通过高通量测序技术进行的，转录组测序主要是针对没有参考基因组（即基因组未完成测序）为什么我画出来的和教程上的不一样？如果测序对象是DNA，比如全基因组，就需要用别的方式来加barcode。目前主要是通过一种经过改造的高效转座酶（transase）Tn5来实现。的物种，侧重于获得你材料的全部转录组信息；而表达谱则侧重于检测各个基因的表达量。