感受态细胞的制备 感受态细胞的制备及转化注意事项

感受态细胞的制备时有什么注意事项

感受态细胞的制备时的注意事项：

感受态细胞的制备 感受态细胞的制备及转化注意事项

感受态细胞的制备 感受态细胞的制备及转化注意事项

感受态细胞的制备 感受态细胞的制备及转化注意事项

1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一

2、在保存感受态时，DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

3、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。

4、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。

5、作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。

扩展资料：

感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

参考资料来源：

如何制备大肠杆菌感受态细胞

（1）挑取大肠杆菌单菌落，接种于5

ml无抗生素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养13h，至对数生长后期。将该菌悬液以1:50

的比例接种于100

ml

LB

液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600＝0.5。

（2）在无菌条件下将培养液转入离心管中，冰上放置10

min，使培养物冷却至0℃，然后4℃，4000rpm离心10min；

（3）弃去上清，倒置1

min，以便将培养液流尽；

（4）用冰预冷的0.1

mol/L的CaCl2溶液10

ml轻轻悬浮细胞，充分混匀，冰上放置30

min后，4℃下4000rpm离心10min；

（5）弃去上清，并倒置1

min，以便的痕量培养液流尽；

（6）加入4

ml预冷含15%甘油的0.1

mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；

（7）感受态细胞100

μL分装，贮存于-70

℃保存备用。

氯化钙制备感受态细胞的原理

细菌处于 0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。

钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。

氯化钙能够改变细胞膜的通透性从而使细胞成为感受态。

感受态细胞的制备

感受态细胞的概念

感受态，指的是细菌在一定的条件下可以吸收外部环境中的DNA的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。

AGL1感受态细胞

实验原理：

目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌.此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收.转化效率可达106-107转化子/微克DNA。

注意：本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验作必须在低温下进行。

具体作：

1、取-70℃冰冻菌种,用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于37℃培养过夜。

2、第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3mlLB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜.次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基500ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。

3、当菌落600nmOD值达到0.3-0.4时,将烧瓶取出放置冰上10~15分钟.在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中.4℃,4000g离心10分钟。

4、弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加10ml0.1MCaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟。

5、4℃,4000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体.每管0.2ml分装,至4℃保存备用,24-48小时内使用效果较好.如果暂时不用,可再保存于-70℃的低温冰箱中。

感受态细胞的制备是什么?

感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温0℃时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。

感受态细胞的特点

理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

感受态细胞的特点为限制缺陷型：外切酶和内切酶活性缺失，外源基因进入后可稳定存在。感染缺陷型：防止重组细胞扩散污染。重组整合缺陷型：外源基因进入后游离在染色体外，不会发生重组。高转化率：易接受外源。遗传互补：与载体有选择标记互补的表型，能够筛选。

如何制备大肠杆菌感受态细胞

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

准备：

一.材料

E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管.

二.设备

恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪.

三.试剂

1.LB固体和液体培养基

2.Amp母液

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板.

4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板.

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌.

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌.

作步骤：

一、 受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右.

二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)

1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟.

2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟.

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液.

4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年.

三、 转化

1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上.

2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后.

3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟.

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ).

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时.

同时做两个对照:

对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现.

对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落.

四、 计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数.

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化.但它们的转化效率并不一定一样.有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率.