重叠延伸pcr技术(重叠延伸pcr技术特点)

几种PCR区别及引物问题求教

多重 PCR，指在一个 PCR 管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重 PCR 检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增 6 个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重 PCR 基础上发展的 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重连接探针扩增技术) 使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重 PCR 耗时的优化步骤。

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重叠延伸pcr技术(重叠延伸pcr技术特点)

重叠延伸pcr技术(重叠延伸pcr技术特点)

重叠延伸pcr技术(重叠延伸pcr技术特点)

反应体系 原位PCR的反应体系与常规的液相PCR基本相同，由于是在经过固定的组织切片上进行，为获得较好的扩增效果，有人主张反应体系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的浓度均应高于液相的PCR反应体系。在反应体系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶与玻片的结合而降低了扩增效率。

Hot start PCR：

热启动 PCR，是提高 PCR 特异性和可信度的的方法之一。通过阻止温度升高到变性温度前的 PCR 反应的发生而阻止引物与基因组 DNA 上潜在的高同源性区域结合引起的错误引发（mispriming）。同时热启动还使引物通过互补区域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。 热启动 PCR 可通过三种方式实现：

1) 手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg 离子或 dNTP），当反应液升温到 80℃以上或变性温度时再加入。手动热启动作繁琐，而且因为增加了一次开盖作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的加样误，可能使平行样品间扩增结果产生异；更简单的手动热启动是在冰上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也

2) 将聚合酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融化石蜡后，酶才进入反应液中；

3) 使用热启动 DNA 聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热启动 DNA 聚合酶相比手动热启动作简便，缺点是用热启动 DNA 聚合酶的价格较高。

Touchdown PCR：

降落 PCR，是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对 PCR 循环条件进行耗时的优化实验。降落 PCR 过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火温度下完成，整个程序的退火温度可降低 10-15℃。

在初几个循环内，高温使引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度的模板序列（很可能这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火，因此保证靶序列得到优先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管终的退火温度降低到足以使非特异性产物有效扩增的温度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此抑制非特异性产物的进一步形成。

Nested PCR：

巢式 PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加 DNA 扩增的特异性。在次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式 PCR 在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。

Multiplex-PCR：

Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）：

Clony PCR：

菌落 PCR，通过 PCR 手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过 PCR 预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为 PCR 反应的模板。菌落 PCR 中使用的引物在插入位点外侧的载体区，因此尽管插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。

RT-PCR（Rrse Transcription PCR）：

逆转录 PCR，是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使 RNA（mRNA）的技术。反应由两个阶段组成：

1. 使用逆转录酶，通过逆转录反应“RT”合成与 RNA 互补的 cDNA（complementary DNA）

2. 使用 PCR 扩增特异性的 cDNA。

由于 PCR 的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些 DNA 聚合酶如 Tth 也有 RT 活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。

RT-PCR 可广泛用于表达图谱分析（用来确定基因的表达）；鉴定 RNA 转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显子和内含子的位置；检测例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的。

RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）：

一种 RT-PCR 方法，当对 DNA 序列信息了解较少时，使用单个特异性引物加一个接头引物来扩增 cDNA 的 5'端（对应转录的起始位点）或 3' 端从而产生新的 cDNA，重叠的 RACE 产物可结合起来产生全长的 cDNA 片段。

DD-PCR (differential display)：

异显示技术，用来鉴定不同组织中异表达的基因。将不同组织的 RT-PCR 产物用短的、非特异性引物进行扩增，然后在凝胶上比对来源于不同组织的条带，只在某种组织中才出现的条带被认为是异表达的。

不对称 PCR，可选择性的扩增出靶 DNA 的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链 DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称 PCR 的基础上发展出 Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，线性指数 PCR)，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。

Assembly PCR(也称作 Polymerase Cycling Assembly 或 PCA)：

通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的 DNA 链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向 DNA 链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装的顺序，因此可有选择性的产生终的长链 DNA 分子。

Mylation-specific PCR (MSP)：

甲基化特异性的 PCR，用于研究基因组 CpG 岛的甲基化模式。首先是用处理靶 DNA，使未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物识别成胸腺嘧啶，然后分别用能区分修饰和非修饰模板的不同的引物来扩增（一对可识别胞嘧啶引物扩增原来甲基化的模板，令一对可识别尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物扩增非甲基化的模板）。结合定量 PCR，可以对甲基化程度进行定量。

Ligation-mediated PCR：

连接介导 PCR，首先使用小的寡核苷酸接头连接靶 DNA 片段，然后选择与接头结合的 PCR 引物来扩增未知的靶片段。这一技术主要用在 DNA 测序、染色体步移技术（genome walking）和 DNA 指纹图谱等。

AFLP（Amplified fragment length polymorphi）：

扩增片段长度多态性，通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。

AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：

Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：

可变数目串联重复序列 PCR，使引物在具有长度多态性的靶基因区，通过在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。

Allele-specific PCR：

等位基因特异性 PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的突变在（或接近）引物的 3' 端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引物不能起始，而只有完全匹配的引物才能起始，产生的产物因此显示不同的基因型。

InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：

一种 DNA 指纹图谱技术，所选的引物在基因组的片段重复区（如 Alu 族），扩增后产生基于不同产物长度的的指纹图谱。

Inverse PCR：

反向 PCR，允许扩增已知序列侧翼的 DNA 区。首先将靶 DNA 用限制性内切酶进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。

Quantitative PCR(Q-PCR)：

定量 PCR，用来测定样本中的靶 DNA 的量。初的定量 PCR 主要是指 Competitive PCR（竞争定量 PCR）。竞争定量 PCR：在反应混合物中加入起始拷贝数已知的内部对照，对照具有同靶序列相同的引物结合位点，但产生的产物长度与靶序列产生的产物长度不同，在 PCR 过程中对照与靶基因竞争相同的引物。反应后通过比对对照和靶基因产生的产物量推断初始靶基因的拷贝数，由于内部对照和靶基因在扩增中的效率不一定相同，所以定量结果会产生偏。

Real-Time PCR：

实时 PCR，由于通常的 PCR 在几十个循环后都会进入平台期，产物的量与初始模板量不在成正比，因此只能用来定性。而实时 PCR 通过使用荧光染料，例如 SYBR Green 或荧光标记探针，例如 TaqMan 可用来检测随着扩增的进行，产物量的变化而进行定量。

重叠pcr为什么很多杂带

模板中蛋白质没有消化除净造成的 。

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。，引物之间形成二聚体等。

定点突变是怎么通过PCR作用达到目的的

4.1用于外源性基因的检测

定点突变是先把突变位点设计在引物上（通常是接近引物），正反引物互补，然后通过普通PCR扩增前后两个片段，胶回收。将两个片段的回收产物混合，用重叠PCR扩增得到全长。这样就通过在中间引物上设计突变的方式达到定点突变。

4.1.2细菌基因的检测

pcr中的引物起什么作用？

你这个想法理论上讲是可行的，但是实际作起来就会存在很大的困难。小片段连接比较难做。根据你的叙述，连原位PCR技术的基本步骤包括标本的制备。原位扩增（PCR）及原位检测等基本环节，现分述如下（重点以石蜡切片为例）。接好的片段约为200bp左右。我建议你把这200bp的片段分成4段，即1，2，3，4段，合成有15个碱基互补的4条引物，1与2，3与4重叠延伸，然后以1与2，3与4的产物为模板，1和4为引物在重叠延伸PCR，这样就ok了，速度会很快的。分成4段是因为引物合成碱基个数小于60个的，按正常收费，这样节约成本。

pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则有哪些

1、pcr的技术的主要步骤：

①dna变性：（90℃-96℃）：双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna

③延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性）的作用下，以dntp为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的dna链。

每一循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍。如图所示：现在有些pcr因为扩增区很短，即使taq酶活性不是也能在很短的时间内完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

2、引物设计的基本原则

②引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c

过多易出现非特异条带。atgc随机分布，避免5个以上Asymmetric PCR：的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

③引物内部不应出现互补序列。

′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，选择是pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则分述如下：g和c。

⑦引物的5

连接反应产物，是否可以直接做PCR模板？要不要先灭活其中的T4连接酶？

这样做实际上是不可行的，效率会很低。我以前也想你一样试过。

原因：粘性末端相连的机会不大，而且要6个同时都相连，机会是呈指数级别下降的。而且如果直接做PCR的话，那些没有连接①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。或者部分连接的片段十个极大的干扰。

2个方案：既然酶切位点独特，建议把A和F修改为直接可以和质粒互补的末端，连接后直接克隆。比做PCR的可能性要大。

或者先做AB， CD， EF连接，克隆后再做两次ABCD+EF连接。

博凌科为-为你解答：理论上讲，你可以这样做，甚至可以直接做PCR而不用连接。这个其实和多对分段克隆基因的原理一样，都是让前一对引物的下游引物，和后一对引物的上游引物有一段互补序列。这样所获得的PCR片段就是前一段的末端和后一PCR引物设计的11条要求段的前端就会有互补序列。但是问题是，这样的前后序列一般有15个碱基左右的互补序列，而酶切位点的互补序列太短。这个需要你把PCR反应的退火温度降低。来保证碱基互补。

微生物代谢工程中的常用基因作技术有哪些

原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。

微生物的基因作技术有：的凝胶电泳、的分子杂交技术、DNA 序列分析、基 因的定点诱变、细菌的转化、利用 DNA 与蛋白质的相互作用进行研究、PCR 技术等。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

基因定点突变(site-directed mutagenesis)：通过改变基因特点核苷酸序列来改变所编 码的氨基酸序列，用于研究氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响， 也可用于改造 DNA 调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。主要采用两 种 PCR 方法，包括重叠延伸技术和大引物诱变法。在硫化细菌核苷水解酶对底物专一性的研 究中，采用定点突变技术，对编码 221 位和 228 位氨基酸的 DNA 序列进行突变，改变两个位点的氨基酸，从而研究氨基酸残基对底物结合的影响。

基因敲除(gene knock-out)：又称基因打靶，通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重 组，进行的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体 DNA 可与目的片段共同稳定 遗传等特点，可分为完全基因敲除和条件型基因敲除。在谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸的研究中，采用基因敲除的方法进行高产菌株构建。如 ilvA 基因敲除，使苏氨酸脱氨酶的合成减少，降低异亮氨酸合成的前体，从而减少异亮氨酸的合成，增加缬氨酸的生成。

【文献】单细胞 T细胞受体(TCR)测序：技术与挑战

引物设计与合目前能少数技术力量较强研究院、所进行临床应用需购买PCR检测试剂盒展工作PCR自热循环影响素同DNA品PCR反应各种份加入量温度循环参数均致

Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges

单细胞T细胞受体测序：技术与挑战

T细胞的特性是能够识别无限范围内的自体抗原和外来抗原。这个能力是靠胸腺发育过程中通过一种基于体细胞重组的复杂分子机制实现的。该机制导致了表面抗原受体有很多种类的群体的表达，这种受体就叫做T细胞受体（TCRs）。TCRs具有细胞特异性，是T细胞的一种分子标记，在淋巴恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤免疫学等多种背景下，TCRs被广泛用于监测T细胞的克隆类型（clonality）和多样性（diversity）。在这篇综述中，我们概述了用于研究TCR指令集的策略，从基于V段识别的先锋技术，到下一代测序所引入的革命，该技术允许阿尔法链和贝塔链的高通量测序。基于单细胞的方法将分析提高到更高的复杂性，现在提供了对成对的alpha和beta链进行排序的机会。我们还讨论了新的方法，通过整合TCR跟踪和mRNA单细胞测序提供了一个有价值的工具，将抗原特异性与转录动力学联系起来，并了解T细胞可塑性的分子机制。

人类T细胞在胸腺中由造血组织的祖细胞发育而来。在它们的发育过程中，它们获得了识别外来抗原的能力，并对许多不同的病原体提供保护。这种功能的灵活性是由高多态性表面受体的表达称为T细胞受体(TCRs)。TCR由两个不同的蛋白质链组成。绝大多数的人类T细胞表达细胞组成的α和β链而表达了TCR组成的一个小子集γ和δ链。αβ T细胞适应性免疫的关键调解人和识别抗原在协会主要组织相容性复合体(MHC)类I和II级蛋白质。γδ T细胞而不是MHC-restricted和参与先天反应组织。αβT细胞代表超过90%的总T细胞群和γδT相比更加多样化;出于这个原因,绝大多数的研究TCR的重点是αβ T细胞。

编码alpha (TCRA)和beta (TCRB)链的基因由多个不相邻的基因片段组成，包括TCRB基因的变量(V)、多样性(D)和连接(J)片段，以及TCRA基因的变量(V)和连接(J)片段。T细胞库的巨大多样性是由系基因片段的随机组合(组合多样性combinatorial diversity)和已连接片段在连接位点的随机添加或删除(连接多样性junctional diversity)产生的。

Alpha和Beta链在体引物的实质是核苷酸序列，是作为DNA开始时DNA聚合酶的结合位点，具体的PCR原理是利用DNA分子会在体外95℃高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时，引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶适反应温度，DNA聚合酶从3'端开始合成新的链的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA分子扩增的目的。细胞上的V（D）J 排列。(A) TCRB和TCRA位点的基因组组织和体细胞重组。抗原库多样性是通过重组步骤来保证的，该步骤逐步重新排列T细胞受体(TCR)β链的V、D和J段，以及TCRα链的V和J段。这种变异性(组合多样性)进一步增加或删除核苷酸在连接位点(连接多样性)。(B)转录本和转录本的生产性重排（productive arrangements）。(C) TCR的结构。TCR由两个亚基TCR Alpha 和TCR Beta 组成，每个亚基分别位于一个恒定区域和一个负责抗原识别的可变区域。

由V(D)J结编码的序列称为互补决定区域3或CDR3。这个序列在α链和β链中都具有的可变性（variability），决定了T细胞识别MHC分子所呈现的抗原肽的能力（Figure 1B）。随后的异二聚体对alpha链和beta链进行配对，进一步增加了组合变异性，估计可能的组合总数超过10e18。T细胞库是动态的，直接反映了免疫反应的多样性:抗原呈递给一个幼稚的T细胞，事实上，与共信号相关联，促使携带相同TCRs的细胞迅速克隆扩增，产生一批“效应细胞”。抗原清除后，这些细胞作为“记忆细胞”留在血液中的数量减少了。“TCR序列的特征一直具有很大的科学价值，因为它准确地描述了T细胞在多种疾病中的动态，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病。

利用流式细胞术和针对TCRBV亚群的单克隆抗体的组合，在蛋白质水平上进行了开拓性实验，以解剖T细胞库。这种方法是定性和定量的，但受限于特定单克隆抗体的可用性，没有提供任何关于CDR3多样性的信息。个基于基因组的方法是基于对群体中CDR3序列长度分布的分析。这种技术被称为免疫镜或CDR3光谱分析，其基础是利用针对不同可变片段和恒定区域的特异性引物，在CDR3区域扩增TCR转录产物，从而获得PCR片段的电泳分析。免疫镜比较了单个TCRBV亚科中不同长度产物的相对频率，该亚科在多克隆群体中呈高斯分布，而在克隆富集中呈偏态分布。个用于在核苷酸序列水平上查询TCR指令集的分子方法是基于传统的分子克隆和Sanger测序。这种方法提供了一个更具体的TCR曲目描述，但它不足以估计巨大的TCR多样性。真正的突破免疫特性的曲目来自高度敏感的高通量测序技术的引入大规模并行测序数以百万计的DNA分子,而不是单一的克隆细胞提供一个全面的知识的安排(α,β链,或两者兼而有之)包括这段和完整的CDR3上序列。

目前的测序技术采用从基因组DNA或cDNA开始的目标富集步骤，既提高了灵敏度，又降低了测序成本。常用的富集策略包括多重PCR、RNA诱饵富集和5’RACE PCR。多重PCR策略使用一个互补于所有可能的V段的多重正向PCR引物池和一个设计在J段(如果从基因组DNA开始)或在α和β链的恒定区域(如果从cDNA开始)上的反向引物池。这两种方法都有优点和缺点。从cDNA开始的PCR富集比基因组DNA有很多优势:(a) PCR伪产物的偏倚更小，因为扩增片段不包含内含子，因此更小;(b) cDNA分析只检测有效排列的片段(“表达的”和链);(c)由于mRNA转录本比模板基因组DNA更丰富，因此它能够更容易地检测较少表达的序列。基于诱饵的富集利用RNA诱饵直接从DNA或RNA测序(RNA-seq)文库中捕获TCR序列，捕获后再进行扩增。诱饵是特定的阿尔法和贝塔转录本，通常是共轭的磁珠。这一过程需要很少的扩增周期，减少PCR相关偏的潜力。

第三种方法是基于转录本的方法，在模板切换（template-switch）步骤之后使用5'RACE。RNA由具有末端转移酶活性的酶逆转录，该酶在cDNA的3 '端添加一段非模板dCTPs。含有聚g束的非模板开关寡核苷酸然后与非模板拉伸结合，并允许逆转录酶切换模板并继续扩展模板直到寡核苷酸的末端。模板开关寡核苷酸包含一个通用序列，所有转录本包括TCR链共享。然后，在该序列上设计的正向引物与在α和β链的恒定区域上设计的反向引物一起使用，以丰富TCR转录本扩增片段的内容，然后可以对片段进行处理，生成测序文库。

使用基因组DNA作为起始材料反而更具挑战性，因为富集通常是通过多重PCR进行的，但内含子的存在和较长片段的扩增可能会引入更多的技术偏。此外，非生产性的重新安排也被放大和排序，使表达的曲目的分析复杂化。这一革命性的方法首次被用于描述健康个体的TCR库多样性，并迅速适应于不同病理环境(如肿瘤免疫学和自体免疫)和多种临床应用(如监测造血细胞移植)中的库分析。

由于beta链具有较高的多样性，与alpha链相比，beta链具有更大的组合潜力，因此一直是所有TCR序列研究的主要目标。此外，β链代表T细胞的一个“独特标签”:T细胞经历了一个称为“等位基因排斥”的过程，导致只产生一个有效排列的β链基因，而两个α链等位基因都可以表达。“bulk”方法的局限性在于缺乏关于α和β链配对的信息，而α和β链配对真正反映了T细胞在体内的生物学功能，只能通过单细胞分析来实现。单细胞TCR全谱分析方法主要采用两种策略:从单细胞cDNA开始直接目标扩增和测序，或从单细胞RNA-seq数据重建TCR。

次尝试测序单细胞TCRα和β链使用与Sanger测序或高通量测序相关的多重PCR策略。Hans和他的同事们用多重PCR方法对浸润人结肠癌的T淋巴细胞的异质性进行了分析，以丰富来自同一细胞的TCR序列和一组“表型基因”。他们还实现了一个基于pcr的单细胞条形码策略来汇集所有的扩增子，并通过NGS对它们进行排序。条形码是一种短核苷酸序列，它记细胞转录本，并用于mRNA转录本的来源。通过这种原始的方法，他们可以将TCR序列与具有不同功能的特定T细胞子集相关联。一个类似的单细胞条形码策略被用来建立高通量的方法来识别具有相同的α和βTCR序列的克隆，并应用于乳腺癌和肺癌的肿瘤浸润淋巴细胞。

上图解释：单细胞T细胞受体(TCR)测序方法综述。直接富集和测序TCR。

在图(A)中，单细胞TCR转录本通过RT反应后的多重PCR进行富集，使用一组正向引物，涵盖所有带注释的V alpha 和V beta 片段，并在α和β链的恒定区域设计反向引物。然后通过PCR添加barcode adapter，并测序。在图(B)中，细胞通过微流体乳化装置以及特定的RT和PCR试剂在油包水的droplets中捕获。在每个液滴中，单个细胞的TCR alpha 和 beta转录本都被设计在alpha和beta链的恒定区域上的RT引物特异性地逆转录。利用设计在所有α和β片段上的正向引物池和设计在恒定区域上的反向引物，依次扩增cDNA。α和β引物在其5 '端包含重叠序列，通过重叠扩展机制可以合成TCRα和β融合序列。熔融分子聚集在一起，打破乳液，并通过巢式扩增和测序进一步丰富。从单细胞“全长”RNA测序(RNA-seq)数据重建TCR。图(C) 用微流体设备分选或捕获的单细胞被裂解，总mRNA通过oligo dT启动反应逆转录。通过模板切换机制，在转录本的5 '端添加一个通用序列。这个序列与RT反应中使用的dT引物共享，然后在文库制备前用于扩增cDNA。在文库制备步骤中，利用转座酶对全长cDNA进行“标记”，然后利用转座酶插入的标记序列对cDNA进行扩增，并插入测序barcode接头(AD1和AD2)。然后对文库进行排序，使用专用的生物信息学算法(TraCer、TraPes、VDJ Puzzle)从所有转录组中提取TCR序列。采用基于乳化剂的单细胞TCR测序和RNA-seq配对。图(D) 成千上万个平行的细胞被分成水滴中的油。裂解步骤后，它们的mRNA被使用含有相同“cell barcode”的特定RT引物池逆转录，该“cell barcode”是一种独特的分子标识符(UMI)，用于标记细胞转录组。每个引物的UMI都是不同的，这使得mRNA转录的数字计数和T7启动子的测序成为可能。然后通过体外转录扩增cDNA。扩增后的barcode RNA汇集在一起进行处理。然后利用扩增的RNA作为模板，对TCR序列进行富集，并根据InDrop协议生成RNA-seq文库。在RNA-seq文库制备过程中，RNA被片段化，只有3 '端转录本被测序。对于TCR富集，扩增的RNA使用一组横跨V alpha 和V beta 段的RT引物进行逆转录，然后使用“内部”V alpha 和V beta 和设计在恒定区域上的引物(primers)进行扩增。在此PCR反应中，还添加了测序barcode(AD1和AD2)。图(E) 成千上万个平行的细胞被分成油包水的液滴中（droplets）。裂解后，用oligo dT引物逆转录它们的mRNA。通过template-switch机制，在转录本的5 '端添加含有cell barcode和UMI的primer。RT反应后液滴破碎，利用设计在dT 和 switch oligonucleotides 上的external primer，将cDNAs pooled 和扩增。然后利用扩增的全长cDNA作为模板，富集TCR测序，或片段化处理，生成RNA-seq文库。TCR富集采用巢式PCR法，正向引物跨越switch oligo，反向引物设计在α和β链的恒定区域。然后将PCR产物部分片段化，加入测序接头(AD1和AD2)。

真正的突破来自于基于乳化剂的PCR技术。这些技术使用的设备可以泵入水中的油状乳剂，成千上万的单个细胞可以被捕获到液滴中，液滴与引物和PCR试剂一起工作，就像一个反应室。这种方法可以大幅增加并行处理的细胞数量，并能够生成具有代表性的单细胞和融合在一起的TCR基因文库。其中，细胞裂解后，在每一个液滴中释放出α和βTCR mRNA，并利用末端重叠的引物进行多重PCR逆转录扩增。在随后的反应中，重叠端退火，允许每条链的3 '端启动互补端3 '延伸。此步骤生成包含序列和序列的融合片段;融合片段在含有“阻断”引物的PCR中进一步扩增，这些引物可以防止未被扩增的片段被扩增。Turchaninova和他的同事应用这项技术来描述人类血液中的T细胞库，但是这种方法已经广泛应用于包括癌症在内的许多研究领域，近在一个超高通量平台上重新调整，允许对数百万个细胞进行TCR配对测序。

单细胞RNA-seq技术的发展也为TCR分析开辟了新的前景。到目前为止，已经开发了许多不同的protocol，主要在细胞分离方法、cDNA合成和扩增以及文库制备步骤上有所不同。单细胞分离方法迅速发展在过去的几年里从手工作到使用微流体或emulsion-based平台的高通量分离方法,这不仅提供了巨大的优势在throughput方面而且在灵敏度和准确性方面由于很小的反应量使用。所有测序方案的特点是在文库制备前的一个逆转录和扩增步骤。常用的扩增步骤不同，可通过PCR或体外转录进行扩增，分为两组:基于标记或全长cDNA测序protocol。

基于标记的策略在逆转录反应中引入“细胞条形码”，为“标记”单个细胞的整个cDNA池提供了可能。“标记策略”已经成倍地提高了通量，因为标记的cDNAs可以在扩增和库准备过程中被汇集，从而大大降低了成本和实验时间。主要缺点是，这些protocol在库制备过程中由于cDNAs片段化而失去了全长转录本的覆盖范围，并且与全长策略相比具有较低的敏感性(可检测基因的数量较少)。相反，全长策略更昂贵、更耗时(每个细胞的cDNA池被处理以生成单个测序库)，但更敏感，可以提供更广泛的信息，包括亚型、剪接和单核苷酸多态性。利用全长方法生成的单细胞RNA-seq数据提取T细胞库和异质性信息。来自scRNA-seq数据的全长(TCR)序列的组装允许alpha和beta链序列配对(在执行“bulk”分析时不可能)，并允许clonality信息与单个T细胞的整个转录组集成。这种方法也呈现非琐碎的分析问题:规范化reference-based组装方法,依赖的一致性读到“参考”体细胞基因组实际上是有偏见的重组和突变(CDR3上是特定为每个细胞)和缺乏一个完整的“参考”基因组需要从头组装为基础的生物信息学工具的发展。

所有可用的工具基本上都结合了基于引用的组装(reads与带注释的基因片段对齐)和从头组装(重建CD3区域)。早用来重建成对TCR和β链的工具之一被称为TraCer (34)。为了验证 TraCer的性能，Stubbington和同事使用SMART-seq protocol和从小鼠脾分离的FluidigmC1系统(Fluidigm Corporation)生成单细胞RNA-seq数据。为了验证所识别的克隆型，他们使用了一种实验方法来丰富TCR序列，该方法使用了一种基于pcr的多路方法，从用于测序库生成的相同cDNA开始，该方法由NGS并行测序。两种策略之间的良好相关性证实了该方法的有效性。在同一篇论文中，他们将这一分析应用于沙门氏菌感染的小鼠模型，并能够监测感染后扩大的克隆型。该方法的优势在于将TCR克隆型与特定的基因表达谱相关联，该基因表达谱提供了对整个CD4+ T细胞群的详细分子描述，并在感染后监测CD4+ T细胞亚群的动态。

同样的方法也被用于分析T细胞亚群的异质性，以解决几个生物学问题，特别是与“肿瘤免疫”相关的问题。“在过去的几年里，T细胞在癌症中的作用已经被广泛研究，CD8+ T细胞和CD4+ T调节细胞被广泛描述分别在几种癌症中抑制或促进肿瘤进展。近，郑和同事利用示踪剂对T细胞浸润性肝癌进行了解剖。他们分析了浸润的Treg和CD8+ T细胞的克隆富集，以了解肿瘤微环境中淋巴细胞募集的分子机制。通过对TCR表达谱的解剖，他们得出结论:Treg细胞在肿瘤中不存在克隆富集，提示从周围招募，而CD8+ T细胞经克隆富集，提示肿瘤内部存在克隆活化和扩增。在相同的研究思路下，陆续开发了scTCR Seq、TRAPes等工具，适用于短读单细胞RNA-Seq文库和VDJ Puzzle，可以同时分析基因表达和TCR多样性，并在抗原特异性循环CD8+ T细胞上进行了开发和验证。

近修改基于标签的策略的尝试有望将来自相同细胞的RNA-seq和TCR测序结合起来。这些方法具有极大的优势，可以大幅增加并行处理的细胞数量，这对于描述非常罕见的T细胞群是至关重要的。

近发表的一篇论文研究了小鼠和人类Treg细胞的T细胞库(41)。在本文中，Zemmour和同事使用不同的单细胞RNA-seq方法分析了Treg细胞的转录表型。他们发现，Treg细胞具有广泛的异质性，某些高度活化的亚群似乎与T细胞的转录相关。他们还表明，具有相同TCR的Treg在转录上比具有不同抗原特异性的Treg更相似，这说明Treg可塑性受TCR成形的影响较大。为了分析TCR指令表，Zemmour和他的同事使用了一种基于乳化剂的InDrop协议(图2D)的修改，该协议目前用于3 ' '端计数。

其中，细胞通过微流体装置形成油包水乳状液被捕获成水滴。细胞被捕获连同裂解缓冲液，试剂，特别是条形码引物，启动RT反应。条形码cDNAs是由上千个细胞并行合成的。将不同细胞的逆转录后的cDNAs通过破碎液滴汇集在一起，利用体外转录进行线性扩增，然后制备测序文库。正如本文所述，这种池策略成倍地提高了吞吐量，因为可以将数千个单元池放在一个库中。然而，片段化步骤牺牲了所有来自mRNA 5 '端(包括CDR3区域)的信息。Zemmour和他的同事们克服了这个问题，他们在线性放大后引入了一个TCR富集步骤，这个步骤使用了一个横跨所有V和beta段的多重RT池。此步骤生成与整个转录组库共享相同条形码的TCR alpha和beta库(图2d)。近，10x基因组公司推出了一种类似的方法，将α和β链测序结合起来，并行地对数千个单细胞进行转录组分析(图2e)。该方法采用商业化的基于乳化剂的微流控平台(Chromium 10x)，可以生成用于单细胞RNA-seq文库制备和TCR目标富集和测序的扩增cDNA。通过PCR对扩增的cDNA进行TCR富集，使用设计在α和β链的恒定区域上的反向引物和设计在第二链合成过程中通过模板开关机制添加在5 '处的寡核苷酸序列上的通用正向引物。每个寡核苷酸包含一个独特的cell barcode，用于标记整个细胞转录组，包括TCR转录本。

T细胞受体库分析已成为了解健康个体和多种病理条件下T细胞生物学的基本工具，目前不仅应用于研究免疫介导性疾病的生物学，而且还应用于监测治疗后的免疫反应。CD3谱分型等前沿技术已被广泛用于提供克隆扩增的信息，但随着NGS技术的发展，在产量和应用方面出现了真正的革命。对成千上万个细胞的TCR进行并行测序是分析T细胞反应库复杂性和多样性的有力工具。这项技术的主要局限在于无法配对测序和测序，这削弱了我们对体内情况的理解。随着单细胞技术的快速发展和扩展，这一关键问题近得到了解决，单细胞技术提供了配对的和单个细胞的序列信息。进一步的复杂性来自于将来自相同细胞的TCR库和基因表达谱联系起来的努力。这种分析提供了对感兴趣的种群的无偏分类，以及每个细胞的转录景观与其TCR之间的关联。这种方法有望开辟新的途径来描述免疫细胞亚群的特异性克隆性，即使是特征不明显的表型亚群也是如此，并为监测与克隆性密切相关的转录动力学效应提供了机会。

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和作步骤（二）

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被，将蛋白质水平又提高到基因水平即分子的观察和，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行及观察。这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。

1基本原理

PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。

原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。

2 基本类型

根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。

2.1直接法原位PCR技术

直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。

常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。

直接法原位PCR技术的优点是作简便，流程短，省时。缺点是特异性较，易出现阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺入到DNA的非靶序列中，造成阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。

2.2 间接法原位PCR技术

间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用为广泛的原位PCR技术。

间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。

间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是作步骤较直接法繁琐。

2.3 原位反转录PCR技术

原位反转录PCR(in sitrse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术，与RT-PCR（液相）不同点在于，进行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。其它基本步骤与液相的RT-PCR相似。

3 基本步骤

3.1 标本的制备

原位PCR技术可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言，以悬浮的完整细胞做原位PCR效果，石蜡切片效果。随着技术方面的一些问题被解决，近年也有从石蜡切片中得到满意的PCR效率的。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，热传导较，热对流不均匀，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更为主要的原因，可能是标本经制片后，细胞缺乏完整的胞浆或核膜，扩增产物易发生弥漫而导致扩增的产物在原位不易保留。绝大多数的病理标本都是以固定，石蜡包埋的形式保存的，若能很好地解决石蜡切片原位PCR的有关技术问题，意义显然是十分重大的。

切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也较好一些，因为切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同时膜结构也较多，防止扩增产物弥散的作用也越明显。但厚切片细胞重叠多，形态学观察的效果就了，分辨率也将下降。

玻片的处理 为防止石蜡切片在PCR和原位杂交过程中脱落，在玻片应作防脱片处理，常用的方法是涂以多聚赖氨酸或用硅烷化处理，一般能防止组织脱落。

蛋白酶的消化作用 在进行原位扩增之前，组织标本需经蛋白酶处理。经蛋白酶消化的组织细胞，可增加其通透性，充分允许反应体系中的各成分进入细胞内，并能很好的暴露靶序列，以利于扩增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根据组织固定的程度进行调整。蛋白酶消化后，要注意加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全去除，因为只要有少量的残留酶存在，都将对随后进行的PCR反应体系的数量TaqDNA酶产生毁灭性的影响。

蛋白酶消化处理组织细胞可提高通透性，有利于后续进行的各反应成分进入细胞内或核内，但同时也使得扩增产物的弥散机会增多，有可能带来阳性或阴性的结果。

原位扩增（PCR）

原位扩增即在组织细胞标本上进行PCR反应，其基本原理与液相PCR完全相同。

引物 PCR所用主要还是要注意引物的设计，其Tm值和GC含量，还有就是该片段的GC含量，如果太高可以加点DMSO。的引物一般为15-30bp为宜，扩增的片断为100-1000bp左右。原位PCR宜用较短的引物。从石蜡切片中提取的DNA很少超过400bp，RNA很少超过200bp，较长序列的扩增易引起引物与模板的错配而导致非特异性反应的出现。

热循环 原位PCR的热循环可在专门的热循环仪上进行，作简便。也可在一般的PCR热循环仪上进行，通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，样品台上的空间用矿物油或水充填，将载玻片至于平台上，即可进行热循环的步骤。

为了保证反应体系在热循环过程不过多丢失，可用清亮的指甲油，矿物油或PAP笔把盖片四周封闭起来。

洗涤 原位扩增结束后，标本应清洗，以除去弥散到细胞外的扩增产物。洗涤不充分，会导致扩增产物在检测时显现，造成背景过深或阳性结果的出现。但是，洗涤过度，也会造成细胞内扩增的产物被洗脱，是阳性信号减弱或丢失。

有作者在扩增后用4%2小时或2%5分钟进行后固定，以使扩增的产物在检测时能很好地保留在细胞内，提高检测的敏感性和特异性。

原位检测 原位PCR的扩增产物检测方法，取决于原位PCR的设计方案，直接法则根据标记分子的性质对扩增产物直接进行原位检测。间接法则需用原位杂交的方法进行检测。

4 原位PCR技术的应用

4.1.1基因的检测

感染的细胞常无较好的检测手段，但当原位PCR技术应用后，使这一极为困难的问题有望解决。

对HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多种的检测，使我们能够成功等观察到这些在、系统肿瘤、肝炎及肝癌中的作用，能够及时发现受感染的人群。

4.1.3导入基因的检测

在转基因动物的研究中，是否导入了基因，在接受基因治疗的患者体内，是否接受了导入的基因，均可用原位PCR技术来证实。因此，原位PCR技术成为重要的检测手段。

4.2 用于内源性基因的检测

4.2.1异常基因的检测

机体内基因的突变、重排、也可用原位PCR技术进行检测，原癌基因，抑癌基因的突变，恶性淋巴瘤免疫球蛋白重链基因的重排，对肿瘤的研究和诊断无一均提供了广阔的应用前景。

4.2.2固有基因的检测

对于机体细胞内只有单个或几个拷贝的低表达固有基因，原位杂交技术因基因拷贝数太少而无能为力，液相PCR虽可进行扩增检测出来，但不能确定含有该基因的细胞类型，原位PCR技术则弥补了上述两种技术的不足，使得我们能够对人类各种基因进行检测，而完类基因图的绘制。

PCR引物设计怎么做 啊？跪求！

6.引物自身

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。

让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：

① 引物应用系列保守区内设计并具有特异性。

② 产物不能形成二级结构。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。

⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧ 引物5′端可以修饰。

⑨ 引物3′端不可修饰。

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值接近72℃以使复性条件。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物为了保证进行充分的扩增，原位PCR热循环中每一步骤的时间可比常规PCR略长些，另外，也可采用热启动（hot start）的方法，即玻片加热到80-94℃时，再立即加入TaqDNA聚合酶。之间

两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。

现有的引物设计软件有primer5.0比较好。

关于重叠PCR加的那20bp，求大虾解答！在线等！

剩下的关于酶之类的条件一般说明书上都有，仔细看看。

你没有弄明白为什么要加着20bp，并不一定必须是20，一般来说满足16个以上的就行，他的目的就是把两段PCR产物连接在一起，就你的疑问中的20bp来说，这个20bp到是重合在一起的，也就是说终的产物这20个bp就只有一个，而且这20bp是原来模板序列中就有的，打个比方，我现在序列是11223344556677889900这条序列分开合成，拆分成11223344和556677889900，那我就得这么做，条链为112233445④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免356，第二条链则为344556677889900，然后再用两头的引物做PCR，就是11223344556677889900了。你只要明白了这20bp加进去的目的以及这个实验的设计方案你就不会有第二问了。