酶切位点被甲基化后还能被识别吗，如果不能被识别，机制是什么

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种两侧，在各个酶的两边加上保护碱基。 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。但实验证明，大多数限制酶对的酶切位点不能切断。类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

口蹄疫是由口蹄疫引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒的方法预防．的主要成分是该病

吧，这样一个是换载体，试试不同的载体，还有就是增加IPTG的量，适当提高诱导温度，延长诱导时间。常规的办法就是这些了。

（1）口蹄疫的遗传物质为RNA，可以以RNA为模板逆转录获11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.得VPI基因．

常用酶切位点 常用酶切位点序列常用酶切位点 常用酶切位点序列


常用酶切位点 常用酶切位点序列


（4）生长素和细胞分裂素 卡那霉素

6，dna点突变常用的检测方法有哪些

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补.

1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphi,RFLP）：由DNA 的多态性,致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,所产生的片段数目和每个片段的长度就不同,即所谓的限制性片段长度多态性,导致段长度发生改变的酶切位点,又称为多态性位点.最早是用Southern Blot/RFLP方法检测,后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法.现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性.x0d2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象别的点突变检测方法（4）过程⑥表示将受体细胞培养成植株的过程，需采用植物组织培养技术．由图可知，重组质粒上含有卡那霉素抗性基因，可用于筛选出含有重组质粒的叶片小段，所以培养基中除了加入各种必需营养物质和生长素和细胞分裂素等激素外，还需要添加卡那霉素．.相同长度的单链DNA如果顺序不同,甚至单个碱基不同,就会形成不同的构象.在电泳时泳动的速度不同.将PCR产物经变性后,进行单链DNA凝胶电泳时,靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时,就会出现泳动变位（mobility shift）,多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变.

什么是基因拷贝数

13.引物设计避添加保护碱基的原则免DNA污染,跨外显子接头区.

如何提高蛋白质的表达量

用我自己理解的话来说 就是一段基因在基因组中出现的次数 如果基因组中这段基因只出现一次就是单拷贝 出现两次及以上就是多拷贝了

protein，那么最常见的办法就是换promoter，换成更强的promoter用来过表达。如果你是在E.coli里面表达的话，我想应该是用的pET

Fragment

3C，4C，5C以及HiC测序技术都有些什么不同？

我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于代测序技术其测序通量有了很大的提升。其实，二代测序比较常见的有罗氏454测序，Illumina等。但目前最为常用的NGS技术就是illumina测序技术，它能够保证在几十个小时内产生几百G甚至上T的测序数据，完全能够满足高通量测序的通量要求。并且其测序准确程度也是完全能够保证。我在这里很决断的说，在目前高通量测序的科研领域，Illumina测序是主导地位的，几乎没有其他的公司可以撼动它。

他们的原理都是不多的，首先都是先交联(Crosslink), 然后在通过一系列的处理，测序，找出来那些地方（locLengthi pair）之间被交联的比较多，来推测染色体的3D结构。3C最早，只能做某一些特殊点的，4C把范围扩大了一些，到HiC，可以给出整个染色体上所有loci之间的相互作用了。后来发现，HiC因为范围大，需要测序的深度太深，但是大部分信号都是没用的，所以就找出一部分关键点来，就是后来的各种XXXHiC和ChIA-PET。3C和XXXHiC, ChIA-PET其实都是HiC的子集，区别是，3C对功能来说，算是随机的子集，因为技术水平不够，哪里能测就测哪里。后来的XXXHiC和ChIA-PET，技术水平已经超过HiC，为了省成本，是哪里重要测哪里

保护碱基加一侧还是两侧

的多态性,不同的酶，对于不同的甲基化修饰反应不一样。特定的酶只能被特定的甲基化修饰封闭。致使DNA

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

为什么pcr 引物设计出来，下游引物加上酶切位点和保护碱基后，有一个Tm值是负值呀？

基本上设计引物的时候用primer5看看就不多了，没有非特异没有自身二级结构，然后T了解了限制性内切酶的来源就知道为什么了，宿主内有一套机制，可以防止外源DNA的侵入。而如何识别哪些是自体的DNA，哪些是外源的，就采用的修饰机制。而甲基化应该是最常用的一种。对自体DNA进行甲基化修饰后，自己的内切酶就不会再进行识别酶切，而对于外源进入的DNA会酶切。M计算就是AT加2GC加4，加在一起就是TM退火温度……不要有连续5个以上一样的碱基，碱基分布均匀一些……就不多了

常用的体外转录载体（带T7启动子的）有哪些

5.我想你这么问应该是做recombinant碱基要随机分布,尽量均匀.

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。1.准备工作(试剂配置和器材准备)1)作流程示意图主要步骤作①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。2.作步骤[1] 制备载体1)载体消化和胶纯化3μg pET载体3μl 10×限制性内切酶buffer10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%)3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要补足水到30μl2)37℃温浴2-4h3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。6)-20℃保存备用。[2]制备插入片段限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T-载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。[3]在pET32a载体中插入片段连接反应2μl 10×连接buffer2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体1μl T4连接酶5-7μl 预制目标基因插入片段加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h-过夜[4]转化转化方法同T-载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。[5]pET重组子鉴定如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。[6]DE3溶原菌的诱导表达(1)、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。(2)、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM(T7启动子)或1 mM(T7lac启动子)，继续培养2-3小时。(3)、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。(4)、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中，离心。(5)、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析(1)、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或处理。(2)、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。(4)若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析。3.总结(注意事项)(1)所有作尽量在冰上作，以避免蛋白质发生变性;(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。(3)构建好的载体进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油(19%)中会导致质粒不稳定。(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到的活性和溶解性。(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到。(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。

实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR 引物时，为保护5`端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。

参照以下real-time PCR引物设计原则：

1.位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果.

2.产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）.

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相太大.

4.G+C含量在40%~60%之间,45-55％.

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补.

8.引物5′端可以修饰.

9.3’端不要以A结尾,3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构（2-3个）.

12.做荧光定量产物长度80-150bp,最长是300bp.

14.引物与非特异性扩增拷贝数是指某基因在某一生物的基因组中的个数序列的同源性小于70％或者有8个互补碱基同源.

15.查看有无基因的存在.基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似.

16.TM值在55-63度之间.

17..引物与非特异性扩增序列的同源性小于70％或者有8个互补碱基同源.

6，dna点突变常用的检测方法有哪些

Polymorphi,RFLP）：由DNA

1．限制性片段长度多态性（Restriction

分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,所产生的片段数目和每个片段的长度就不同,即所谓的限制性片段长度多态性,导致段长度发生改变的酶切位点,又称为多态性位点.最早是用Southern

Blot/RFLP方法检测,后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法.现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性.x0d2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象别的点突变检测方法.相同长度的单链DNA如果顺序不同,甚至单个碱基不同,就会形成不同的构象.在电泳时泳动的速度不同.将PCR产物经变性后,进行单链DNA凝胶电泳时,靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时,就会出现泳动变位（mobility

shift）,多用于鉴定是否存在突变及诊断10.引物3′端要避开密码子的第3位.未知突变.