bca蛋白定量试剂盒_雅酶bca蛋白定量试剂盒

96孔板怎么37度水浴

较高

放置30分钟。根据查询蛋白质的定量测定(BCA试剂盒法)实验报告得知：将配好溶液的96孔板放置30分钟在37℃恒温水浴箱中，30分钟后将96孔板放进酶标分析仪中试剂：丽春红染色液进行结果的检测。

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蛋白质含量测定方法

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、NC膜和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率。各种膜的技术参数及比较如下：

蛋白质含量测定分析方法有：马斯亮蓝法（Bradford）、Folin酚试剂法（Lowry）、BCA法等。

蛋白纯化是目前生物研究邻域中较为热门的一个大方向，其中蛋白含量测定是纯化过程中很重要的一项内容。

Folin酚试剂法（Lowry）是目前最灵敏的测定方法，但耗费时间长，作需严格计时，颜色深浅随不同蛋白质而变化，因为其中的酒石酸钾-硫酸铜试剂配置保存困难，逐渐被考马斯亮蓝法取代。

考马斯亮蓝法（Bradford）是采用考马斯亮蓝G染料与蛋白质结合，应用广泛，颜色稳定，专一性较，干扰物质多。

BCA法主要基于双缩脲原理，用于快速检测，抗1.将7.620g四硼酸钠和20mgSDS用150ml去离子水溶解，必须完全溶解在加入其它试剂干扰能力强，但受金属螯合剂影响。

每种测定方法都不是完美无缺的，都有其优缺点，在选择时应考虑：试验所要求的灵敏度和度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定时所耗费的时间等因素。就具体情况选择最合适的试验方法。

测蛋白水解度要用什么试剂盒

（4）摇动结束后，用蒸馏水重复漂洗2—3次直至出现清晰条带，如条带清晰整齐则表明之前Western Blot 步骤成功

建议您用：

>400ug/cm2

OPA测定方法：

OPA试剂

;2.用4ml乙醇溶解160mg邻苯二甲醛（OPA）并将此OPA溶液完全溶解后再加入其它试剂;

3.向A1中加入176好客DDT(99%),用去离子水冲洗;

4.

容至200毫升;

5.该试剂对光敏感，应在配制当天使用。

如何应用Snothern blot检测镰刀型红细胞？

膜蛋白

成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：

2，吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析

3，处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

4，处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！

二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性

内参对照：检测标本的质量和二抗系统

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

WB检测基本过程

1、获取细胞或组织裂解物

1）根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：

buffer

NP-40 or RIPA

胞浆（可溶性蛋白）

Tris-Triton

NP-40 or RIPA

RIPA or 白提取试剂盒

线粒体蛋白

RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2）选择合适的蛋白酶，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白

3、电泳分离蛋白质

根据待测蛋白状态确定电泳条件：

待测蛋白状态

凝胶条件

上样buffer

电泳buffer

Reduced - Denatured

还原，变性

含β-或DTT，含SDS

含SDS

Reduced - Native

还原，不变性

含β-或DTT，不含SDS

Oxidized - Denatured

不还原，变性

不含β-或DTT，含SDS

含SDS

Oxidized - Native

不还原，不变性

不含β-或DTT，不含SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量（kDa）

凝胶浓度（％）

20

12-45

胞浆（骨架结合蛋白）15

10-70

12.5

15-100

10

25-200

PVDF膜

NC膜

尼龙膜

灵敏度和分辨率

高高

高背景

低低

蛋白结合能力

100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）

80-100ug/cm2

机械强度

强干的膜易脆

软而结实

溶剂抗性

强

使用前是否需要浸润

甲醛润湿

缓冲液润湿

缓冲液润湿

适用染色方法

胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰

胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁

适用检测方法

显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测

显色法、化学发光、荧光、放射性

显色、化学发光、放射性

适用范围

普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测

普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白

低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、检测常用

价格

高较低

低

测蛋白水解度要用什么试剂盒

1，凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析

建议您用：

OPA测定方法：

OPA试剂

;2.用4ml乙醇溶解160mg邻苯二甲醛（OPA）并将此OPA溶液完全溶解后再加入其它试剂;

3.向A1中加入176好客DDT(99%),用去离子水冲洗;

4.

容至200毫升;

5.该试剂对光敏感，应在配制acid当天使用。

生物科研实战——Western blot

1.蛋白样品提取：

（2）吸出培养液，加入1ml预冷的PBS清洗一遍，加入PBS时务必沿着板壁注入，避免触碰到孔板底部导致细胞脱落。

（4）用细胞刮轻柔的刮下细胞，将刮下来的细胞连同PBS一起吸入1.5mlEP管中，（注意吸除干净）

（5）将EP管放入离心机中离心耗材：滤纸、PVDF膜或NC膜、乳胶手套等，3000r 1min

（6）吸除上清，务必完全吸除干净

（7）汉恒生物RIPA裂解液的配置：RIPA裂解液、蛋白酶（按照1:100体积比分别吸取2ml RIPA裂解液、 20ul蛋白酶（PI）,颠倒混匀。【此过程冰上作】

（9）取出上清，依次移取样本上清至对应的新EP管中

2.蛋白样品定量

试剂：BCA试剂A、BCA试剂B、BCA标准品

蛋白定量工作液配制：将汉恒生物BCA试剂A液与B液按照50:1混合均匀

（1）将10ulBSA标准品以及稀释后的待测蛋白样品加入96孔板，每个样品2个复孔

（2）将配置好的蛋白定量工作液加入96孔板中，每孔200ul

（3）将96孔板放入37℃恒温箱中反应30min

（4）将反应完的蛋白样品置于酶标仪进阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率行蛋白样品浓度测定

（5）根据测定的蛋白浓度用RIPA裂解液将不同样品平衡同一浓度

3.蛋白样品变性处理

试剂：SDS-PAGE蛋白上样缓冲液

（1）将汉恒5X样品缓冲液与蛋白样品4:1混合后涡旋振荡混匀

（2）将蛋白样品置于95℃水浴锅中水浴10min

（3）蛋白样品配置完毕可置于-20℃以下保存备用

4.蛋白PAGE胶的配制

（1）玻璃板装配：将玻璃板擦干净，放入制胶器中夹紧

（2）按照配方配制不同浓度的分离胶（下层胶）

（3）将配置好的分离胶灌入玻璃板夹层，加入压平分离胶，待凝固，一段时间后，分离胶与出现明显的分界线，提示上层胶完全凝固。

（4）倒出上层，用滤纸吸干残余的

（5）按照配方配制不同浓度的浓缩胶（上层胶）

（6）加入浓缩胶，插入梳子，待凝固。

5.蛋白凝胶电泳

（1）取出PAGE胶，装入电泳槽，上推胶板以避免漏液，装入垂直槽电泳架，装入电泳槽，加入电泳缓冲液

（2）轻柔缓慢拔出梳子，以免破坏胶孔，将槽内电泳液补满。

（3）按照上样顺序进行点样，样本浓度、体积须保持一致

（4）加入蛋白分子量Marker

（5）在泳道两侧加入10ug保护蛋白（即普通蛋白样本）以防止电泳时出现边缘效应

（6）对应正负极盖上盖子，红对红，黑对黑

（7）将电压调至80V进行电泳，气泡出现指示电泳开始，待蛋白样品电泳至下层分离胶时暂停电泳，将电压调至120V继续电泳

（8）根据Marker指示，待目的蛋白电泳至分离胶三分之二处停止电泳。

6.转膜

（2）倒入预冷的转膜液，将转膜夹和海绵完全浸入缓冲液中，放置滤纸（需完全浸湿），确保滤纸与海绵之间无气泡

（3）将电泳完的凝胶玻璃板取出，按照蛋白Marker 切割目的蛋白所在区域的凝胶

（4）将目的蛋白凝胶置于滤纸上，并用转膜液浸湿，将泡完甲醇的PVDF膜置于凝胶之上膜的右上角对应凝胶的右上角

（5）赶除PVDF膜与凝胶之间的气泡，盖上润湿的滤纸，放置时不要引入气泡，合上转膜夹

（7）将电流调至200mA进行转膜

7.丽春红染色

（1）取出汉恒生物丽春红染液待用

（2）转膜完成后，取出PVDF膜，膜上蛋白Marker清晰，胶上无明显蛋白Marker表明转膜完全，去除无蛋白区域，将膜的右上角以便确认膜的方向

（3）将膜置于TBST中清洗，置于汉恒生物丽春红染液中，置于摇床摇动3—5分钟。

（5）置于TBST中重复清洗2—3次直至染液褪去

8.封闭

（1）将PVDF膜取出放入预先配制好的脱脂牛奶（3%—5%）室温缓慢摇动1个小时

（1）将配置好的一抗倒入抗体孵育盒，将封闭完的PVDF膜用TBST清洗一遍后置于一抗中，置于4℃冰箱或者冷库缓慢摇动过夜

（2）过夜后将孵育了一抗的PVDF膜置于TBST中重复清洗3次，每次10min

10.显影

试剂：超敏ECL化学发光试剂盒（A液）、超敏ECL化学发光试剂盒（B液）

（1）将汉恒生物影底物A液和B液1:1混合均匀

（3）置于Bio-rad自动显影仪器进行目的蛋白显影

11.去除一抗二抗（strip膜再生）

Western 一抗二抗去除液（stripping buffer）,用于Western中转移了蛋白的膜的重复利用。在Western中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测tubulin、actin等表达量相对稳定的蛋白作为参照，或检测某蛋白的翻译后修饰的表达量（磷酸化等）后进行该蛋白的总蛋白表达量检测进行比较。通过使用一抗二抗去除液，充分去除一抗二抗，可以非常方便地重复利用使用过的膜检测其他蛋白。和重新跑一个SDS-PAGE胶相比，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误，使可比性更强。

（1）将显影完的PVDF膜置于汉恒生物一抗二抗去除液中漂洗10min，室温摇床

（2）弃除一抗二抗去除液并吸尽残余液体加入TBST漂洗3次，每次5min

（3）Strip完成后可再次进行封闭、一抗二抗孵育等Western Blot作

索莱宝蛋白浓度测定试剂盒怎么样

不知道你说的是以下哪三种呢？感觉都还可以

Bicinchoni（2）将PVDF膜控干后平铺于一次性PE手套上，，将汉恒生物显影液均匀涂在PVDF膜上，避光孵育2minnic

(BCA

)法是在世界上常用的蛋白浓度检验方法之一BCA法基础上改进而成。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu

2试剂：RIPA裂解液、蛋白酶+

络合并将Cu

2+

还原成Cu

+。两分子BCA与一个Cu

nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，在50-200μg/ml浓度范围内有良好的线性关系，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

Bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。Coomassie

brilliant

blue

nm变为595

nm，溶液的颜色由棕色变为兰色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。灵敏度比Lowry法高4倍，与BCA法相当。反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。作简便，只需要一种反应试剂。干扰物质少，钠钾镁离子、Tris、葡萄糖和蔗糖、甘油、、硫酸氨、EDTA等均不干扰测定。提供5×染料浓缩液可进行200-400T标准2

ml比色杯检测，或0Tmicroplate检测。

用试剂盒提取的蛋白怎么检测浓度

应用的蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成。

可检测浓度下限达25μg/ml的蛋白样品，最小检测蛋白量达到0.5μgLowry法包括两步反应：步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。定量范围为5～100μg/ml蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均（3）将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动1小时有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。，待测样品体积为1-20μl。 取适量25mg/ml蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.5mg/ml 古朵生物 生化试剂

叙述生物样品中蛋白质含量测定方法有哪些

western blot原理：western blot技术主要是通过电泳技术区分不同的蛋白质组分，并将所分离的蛋白质转移至固体支持体上，通过特异试剂和抗体作为探针，对靶蛋白分子含量进行检测的一种方法。

概述：目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

注意点：值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越（8）加入配置好的100ul汉恒生物RIPA裂解液到去除上清后的离心管中，吹打均匀，置于冰上裂解30min，12000r 4℃ 10min广泛的应用。

bca试剂盒测蛋白浓度的时候 sds有没有影响

需要注意的是，不同的蛋白质定量测定方法可能会对实验器材的要求有所不同，具体的实验步骤和所需器材可以参剂盒说明书或相关文献。如果您在进行蛋白质定量测定时有疑问，建议您咨询相关专业人士或者寻求帮助。

BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂(DTT，)和脂类的影响

蛋白位置