过表达载体构建方法过表达载体的意义

2024-11-10 09:55 生活资讯

如何构建一个基因的过表达载体

4、再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子2 重组法，利用同源重组将外源基因整合到表达载体，外源基因可以先联到一个含重组位点的中间载体，然后用重组酶将其置换到表达载体，转化到感受态细胞，筛选出阳性克隆。。

1、首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。

过表达载体构建方法过表达载体的意义

2）选择合适的表达载体（真核、原核、噬菌体、某些、标记等）

3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。

请教一下基因表达载体构建的原理和作步骤

2、用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

先回答你的问题，转入外源基因的农杆菌不能较载体，它本身是外源基因的受体，携带外原理：将外源基因片段与载体连接（载体通常选用质粒或者噬菌体或其他），将重组的载体转染受体细胞，使之整合入宿主基因组或者在稳定存在于胞质内，是宿主细胞能够表达载体上的外源基因，从而获得新性状或者新产物。源基因的质粒或者噬菌体才是载体。

过表达载体的主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗筛选gene。

你想问基因表达载体的构建，这个问题太大，而且表达载体多种多样，用处也很多，所以很难一下子概况。我只能大概说一下：

1）从基因组或cDNA上克隆得到完整的目的基因（至少包含CDS区），通常在两端加粘性末端或重组位点

5）筛选阳性的宿主细胞并扩繁

什么是过表达转基因植株的创制？

4）将重组载体通过某种手段转入受体，即宿主中（化学转染、脂质体、电转、显微作等）

图1. 过表达载体构建示意图目前已从动物、植物、及微生物中分离到许多适用于植物大概步骤：的启动子。根据作用方式及功能可将启动子分为3 类：组成型启动子（constitutive promoter）、诱导型启动子（inducible promoter）和组织特异型启动子（tissue-specific promoter），这种分类基本可反映各自特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼具其它类型启动子的特征。目的基因过量表达载体构建完成后，有多种使用途径，其中最常用的有以下两种：一，通过农杆菌介导或基因枪法等转化稳定表达系统，如拟南芥、水稻、烟草、番茄等，获得转基因阳性苗；二，通过PEG-Ca2+介导转化法或电击法转化原生质体，如水稻、拟南芥，或通过农杆菌侵染或注射法转化烟草叶片，进行亚细胞定位或蛋白互作验证等实验。（一）过表达转基因植株的创制将目的基因导入植物细胞（特指稳定表达系统）通常可通过农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪法、显微注射法等进行，其中，农杆菌介导法是较常用的遗传转化方法，另外，单子叶植物也可用基因枪法，绿色开花植物可采用花粉管通道法，因为容易作且经济实惠。

过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者载体中，达到在目的基因过量表达的作用。