柱层析的三，上样方法

1、20cm在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是物理和化学作用两种.物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范德华力.化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用。色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常多采用直径为0.07～0.15mm的颗粒。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流3、2mol／L速，均按各品种项下的规定。X 1cm层析管 2、试管

急求：离子交换柱层析分离氨基酸的讲义

作用原理 聚凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应.它有两种形式：（1）非变性聚凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开.

二、原理

层析柱原理和使用方法 层析柱装置图层析柱原理和使用方法 层析柱装置图


层析柱原理和使用方法 层析柱装置图


其他常用的层析方法如树脂层析，其原理是根据分子之间的相互作用力异进行分离。例如电荷、亲和力、分子大小等，使用不同的树脂材料可以实现不同物质的纯化。

5、部分收集器 6、搪磁杯

学习用阳离子交换树脂柱分离氦基酸的作方法和基本原理.

四、试剂和材料

2 、2 mol／L盐酸溶液

4、标准氨基酸溶液 天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸均配制成 2 mg／mL的0.1M盐酸溶液.

5、混合氢基酸溶液将上述天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸溶液按1：2．5：10的比例混合.

7、显色剂 2 g水合茚三酮溶于 75mL中．加水至 100 mL.

8、50%乙醇水溶液

3、氨基酸的鉴定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮显色剂并混匀,在沸水浴中淮确加热15分钟后冷却至室温．再加15 mL的50％乙醇液.放置10分钟.以收集液第2管为空白,测定A570nm波长的光吸收值.以光吸收值为纵坐标,以柱洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线.以已知3种氨基酸的纯溶液为样品,按上述方法和条件分别作,将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照．可确定3个峰的大致位置及各蜂为何种氨基酸.

p柱层析 N柱层析

目的是分离混合物，获凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，1.凝胶颗粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络图1、凝胶渗透层析原理示意图内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。得一定数量的纯净组分，这包括对有机合成产物的纯化、天然产物的分离纯化

分别是阳离子和阴离子交换层析，两者原理类似，根据分离物质的带电属性进行分离，只不过一个是根据带正电的多少，一个是根据带负电的多少进行上柱和洗脱。

方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱柱中并用带有平面的玻棒压紧；供试品可溶于固定液，混以少量载体，加在预制好的色谱柱上端。洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。

请简述可用于蛋白质分离纯化的四种方法及其原理?

3、吸管． 4、恒压洗脱瓶

原理：将具有特殊结构Sober 和 Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上， 还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。 近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、、肽、寡核苷酸、、噬菌体和多糖的分离和纯化。它的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中.那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液,改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来.

4.盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象.是蛋白质分离纯化中经常使用的方法,最常用的中性3.聚凝胶电泳：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸.盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等.

层析柱的中压分离层析柱作方法

三、器材

以中压柱层析法提取分离冬凌草甲素为例 以一定比例的一丙酮为洗脱液，60ML/MIN的流速进行梯度洗脱，柱的使用压力为2～ 3KG/C 。按每份500ML收集，TLC检识展开剂丙酮一(2：8)，显色剂5%香草醛浓硫酸乙醇液

1. 吸附柱色谱2、氨基酸的洗脱：用P H5.8的柠檬酸缓冲液流洗平衡交换住（装置如图）.调节流速为 0.5 mL／min,流出液达床体积的4倍时即可上样.由柱上端仔细加人氨基酸混合液0．25—0．5 mL,同时开始收集流出液.当样品液弯月面靠近树脂顶端时,即刻加入0.5 mL拧檬酸缓冲液冲洗加样品处.待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时.再加入0．5 mL缓冲液.如此重复两次,然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面）,并将柱与洗脱瓶和部分收集器相连.开始用试管收集洗脱液,每管收集lmL．共收集60一80管.原理

硅胶做固定相，采用柱层析分离生物碱，用什么处理层析柱

1.亲和层析：利用P-itive,N-negative分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术.

柱层析原理: 柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离.一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附.当采用溶剂洗脱时,发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程,吸附力较强的组分,移动的距离小,后出柱；吸附力较弱的组分,移动的距离大,先出柱. 硅胶柱层析流动相：极性小的用：系统；极性较大的用甲醇：系统；极性大的用甲醇：水：：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸一般都是利用极性相似相容原理,看流动相与固定相的极3、样品处理：将需要纯化的样品按照要求进行预处理，如pH调整、去除杂质、滤清等。性,大部分是固定相的极性小于流动相,然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近,从而将物质洗脱下来.

凝胶渗透柱层析

2、制备洗脱缓冲液：根据需要进行缓冲液的配制，与凝胶填料相7、电炉 8、分光光度计匹配。

凝胶层析的关键在于建立液固相平衡，然后以合适的洗脱速度将不同物质分离流出。温度高有利于快速建立液固相平衡。但是，温度高也造成溶质在液体中会扩散太快，导致分离效率降低。

2.凝胶过滤：利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚凝胶等）,根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同,因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法.

层析柱带砂芯的怎么用

一、目的

1、6、柠檬酸－一盐酸冲液（pH5.8）,钠离子浓度0 .45M）使用砂芯层析柱时，轻拿轻放，并注意保护好其它玻璃器皿。

2、水浴时因茚三乙醇溶液挥发易引起手部皮肤染色，请尽量用试管夹或毛巾取放试管。

凝胶过滤层析原理

凝胶过滤层析原理是利用具有网状结构取柠檬酸（C6O7H8.H20 ）14.25g、9.30g和 浓盐酸 5．25 mL溶于少量水后,定容至 500 mL,冰箱保存.的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

凝胶过滤层析是一种溶液分离技术，常用于生物化学、分子生物学和生物技术领域中的分离纯化和鉴定分子量的方法。它利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用分离样品中的不同尺寸的物质。

在凝胶过滤层析中，样品混合物通过一个具有不同孔径大小的凝胶层，大分子的样品被筛选出来，只有小分子样品能够穿过凝胶，沿着孔道内流动，进而保留在层析柱的凝胶层不同深度的位置，最终实现分离纯化的目的。

1、不需要任何先验知识，只需了解分子量范围，即可进行分离；

2、应用范围广，可用于蛋白、多肽、DNA/RNA等生物分子的分离和纯化；

上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。因此，凝胶过滤层析是一种十分常用和有效的分离纯化方法，已经成为生物分离领域不可缺少的工具之一。

凝胶过滤层析的方法

4、层析柱装载：将处理好的样品加入均匀膨胀的凝胶填料糖1、准备凝胶填料：选择合适的凝胶填料，例如Sephadex等，按照说明书进行膨胀、洗涤等处理。球中，在层析柱上均匀填充。

离子交换层析的原理是什么? 已解决

在吸附柱色谱中，吸附剂是固定相，洗脱剂是流动相，相3、分离过程中不需要应用强流速或冲击压力，对生物大分子的生物活性不会造成影响。当于薄层色谱中的展开剂。吸附剂的基本原理与吸附薄层色谱相同，也是基于各组分与吸附剂间存在的吸附强弱异，通过使之在柱色谱上反复进行吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程而完成的。所不同的是，在进行柱色谱的过程中，混合样品一般是加在色谱柱的顶端，流动相从色谱柱顶端流经色谱柱，并不断地从柱中流出。由于混合样中的各组分与吸附剂的吸附作用强弱不同，因此各组分随流动相在柱中的移动速度也不同，最终导致各组分按顺序从色谱柱中流出。如果分步接收流出的洗脱液，便可达到混合物分离的目的。一般与吸附剂作用较弱的成分先流出，与吸附作用较强的成分后流出。

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团保护好玻璃器皿。制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。