dna聚合酶作用过程 dna聚合酶作用过程视频

dna聚合酶作用有什么，求详解

宽泛的来讲，DNA聚合酶就是催化脱氧核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA合成，此过程经常发生在：细胞分裂S期DNA，DNA损伤修复，DNA重组，体外DNA扩增（PCR）等等

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细致的来说，以原核生物为例：

DNA聚合酶大概有五类，I类具有5‘～3’的聚合酶活性，3‘～5’的外切酶活性，5‘～3’的外切酶活性，主要作用是纠错，切除DNA过程中的RNA引物等等

II类是次要的修复酶，辅助I类酶

III类是主要的酶，具有5‘～3’聚合酶活性，3‘～5’的外切酶活性，具有纠错功能。

IV类与V类主要是当DNA过程中出现难以及时修复的损伤的时候而激活的SOS应急机制的酶，可以越过损伤区，允许错误的存在以此换取细胞的继续存活的机会。所以这两类酶都没有严格的纠错活性。

真核生物的酶种类与数量更多，功能也更复杂，但是大概的方向和原核是类似的。

dna聚合酶的特点及其作用

dna聚合酶的特点：

[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;

[2]需要模板和引物的存在;

[3]不能起始合成新的DNA链;

[4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端;

[5]催化DNA合成的方向是5'→3'。

dna聚合酶的作用：

[1]聚合作用：在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。

[2]3'→5'外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3'末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3'→5'外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA的.真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA真实性好，变异率低。可见，3'→5'外切酶活性对DNA真实性的维持是十分重要的。

[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用：5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。

[4]焦磷酸解作用：DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA

[5]焦磷酸交换作用：催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。

反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA

两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。

DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nick translation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoIⅠ能从切口开始合成新的DNA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。

尽管DNApolⅠ是个被鉴定的DNA聚合酶，但它不是在肠杆菌中DNA的主要聚合酶。主要证据如下：

[1]纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DNA合成速率要比此高二倍数量级;

[2]大肠杆菌的一个突变株中，此酶的活力正常，但染色体DNA不正常;

[3]而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA却正常，而且此突变株增加了对紫外线、烷化剂等突变因素的敏感性。这表明该酶与DNA关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用。

实验室常用的耐热DNA聚合酶：

耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除错配，切平末端;5'-3'外切酶活性可以消除合成障碍。由于上述这些不同，可以将耐热DNA聚合酶分为三类：

一、普通耐热DNA聚合酶

Taq DNA 聚合酶

由一种水生栖热菌yT1株分离提取出，是发现的耐热DNA聚合酶中活性的一种，达200,000单位/mg。具有5'-3'外切酶活性，但不具有3'-5'外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。

TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3'加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3'突出的单A核苷酸尾;另一方面，在dTTP存在时，它可将平端的质粒的3'端加入单T核苷酸尾，产生3'端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。

Tth DNA 聚合酶

从Thermus thermophilus HB8中提取而得，该酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA;当加入Mg2+后，该酶的聚合活性大大增加，从而使cDNA合成与扩增可用一种酶催化。

二、高保真DNA聚合酶

pfu DNA 聚合酶

是从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无3'端突出的单A核苷酸。

Vent DNA 聚合酶

该酶是从Litoralis栖热球菌中分离出的，不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能。

三、DNA序列测定中应用的耐热DNA聚合酶

Promega公司测序级TaqDNA聚合酶

是在TaqDNA聚合酶的基础上对它进行修饰，去除5'-3'外切酶活性，保证测序记过的高度准确性，可产生强度均一的测序条带，背景清晰。

Bca Best DNA 聚合酶

从Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提纯，并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸长性能优越;可抑制DNA二级结构形成，可以得到均一的DNA测序带。

Sac DNA 聚合酶

从酸热浴流化裂片菌中分离，无3'-5'外切酶活性，可用于DNA测序，但测序反应中ddNTP/dNTP的比率要高。

DNA聚合酶的作用

DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶的作用：聚合作用、校对作用、切除修复作用。

DNA聚合酶是一种参与DNA的酶。它主要是以模板的形式，催化脱氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子将会组成模板链并再进一步参与配对。

聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。这是DNA聚合酶的主要作用;

3’→5’'外切酶活性(校对作用)：这种酶活性的主要功能是从3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，3’→5’外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3’→5’外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸，可见，3’→5’外切酶活性对DNA真实性的维持是十分重要的。以保证过程的保真性和准确性;

5’→3’外切酶活性(切除修复作用)：该活性是从5’→3’方向水解DNA延长链前方的DNA链(即只对DNA上双链处的磷酸二酯键有切割作用)，主要产生5'—脱氧核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。

聚合酶链式反应过程

聚合酶链式反应需要一定的时间，那么聚合酶链式反应过程是什么样的呢？

聚合酶链式反应步骤分为三步：聚合酶链式反应DNA变性（90℃96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA聚合酶链式反应退火（60℃65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

DNA骨架结构是由磷酸与糖类基团交互排列而成。组成脱氧核糖的糖类分子为环状的2-脱氧核糖，属于五碳糖的一种。磷酸基团上的两个氧原子分别接在五碳糖的3号及5号碳原子上，形成磷酸双酯键。这种两侧不对称的共价键位置，使每一条脱氧核糖长链皆具方向性。双螺旋中的两股核苷酸互以相反方向排列，这种排列方式称为反平行。脱氧核糖链上互不对称的两末端一边叫做5端，另一边则称3端。脱氧核糖与RNA最主要的异之一，在于组成糖分子的不同，DNA为2-脱氧核糖，RNA则为核糖。

DNA聚合酶有哪些特点？其作用是如何发生的？

（1）DNA聚合酶的活性，需要模拟和引物，polI主要用于DNA 的修复和RNA引物的替换。

（2）3’→5’外切酶活性，具校对功能，作用于单链

（3）5’→3’外切酶活性，作用于双链，被认为用于切除嘧啶二聚体和冈崎片断5’引物的切除

（4）由3’端使DNA链发生焦磷酸解

（5）无机焦与脱氧核糖核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换

DNA聚合酶,解旋酶,RNA聚合酶各自的作用对象和作用时期（详细）

DNA聚合酶：在DNA时，作用于游离的脱氧核苷酸，将游离的脱氧核苷酸连接形成新的脱氧核苷酸长链。

解旋酶：在DNA、转录时，作用于DNA双链，将双链DNA解开形成单链。

RNA聚合酶：在转录过程中，作用于游离的核糖核苷酸，将它们连接形成mRNA链