尺寸排阻色谱法_尺寸排阻色谱法的固定相是

液相色谱按分离原理分可分为几种？

分子筛色谱 molecular si chromatography 是20世纪60年代发展起来的一种快速简便的生物化学分离分析方法。基本原理是指混合溶质的分子按其分子量的大小不同，分别先后流出色谱柱而被分离。

分配色谱法 利用样品在固定相中的溶解度不同

尺寸排阻色谱法_尺寸排阻色谱法的固定相是

尺寸排阻色谱法_尺寸排阻色谱法的固定相是

尺寸排阻色谱法_尺寸排阻色谱法的固定相是

尺寸排阻色谱法_尺寸排阻色谱法的固定相是

吸附色谱法 利用样品在固定相中的吸附能力不同

离子交换色谱法 利用样品在固定相中的亲和力的不同

1.液— 液分配色谱法

2 ．液 — 固色谱法

3 ．离子交换色谱法

4 ．离子对色谱法

6 ．空间排阻色谱法

建议你去“色谱此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。世界”网站看看吧，这个网站在色谱方面非常专业。有很多专业人士，对你解决色谱方面的问题会有很大帮助。

HPLC法中定量分析方法大致有哪几种？

凝胶色谱法 利用样品在多孔固定相中选择性渗透

高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um 的吸附剂（ 硅胶、氧化铝等）。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小（5um-10um）、传质快、柱效高。

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。

类型：

吸附色谱

在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。

吸附色谱所使用的流动相以、、作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，是使所加入醇的浓度为10%或更少一些。如有可能，可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。

分配色谱

1.正相分配色谱

正相分配色谱适用于不溶于水而溶于且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。

2.反相分配色谱

这种方法应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。

通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的PH值，例如，如果样品有一个—COOH 基团，使流动相的PH值是偏向，由于抑制了—COOH基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。

在调节PH值中，保持PH值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，当加入盐以后，使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的PH值。

离子交换色谱

这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。

离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、PH及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有、醋酸盐和硼酸盐5、体积排阻色谱是一种通过化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的别来实现分离的方法。它主要应用于高分子量高聚物分子量的测定。。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用NaCl或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在210nm，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。

凝胶色谱

凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。

因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。通常合成树脂的分离使用作流动相，叫做凝胶渗透色谱。

凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。

凝胶渗透色谱（GelPermeationChromatography），简称GPC。此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脱液有THF，Chloroform等等。

2.凝胶过滤色谱

凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。

标准曲线法

标准加入法

外标法

示法

hplc原理

Xm + nSa ====== Xa + nSm

hplc原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

高效液相色谱仪是应用高效液相色谱原理，主要用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物的仪器设备。它由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两2、样品分子与固定相之间不存在相互作用，色谱固定相是多孔性凝胶，仅允许直径小于孔径的组分进入，这些孔对于溶剂分子来说是相当大的，以致溶剂分子可以自由的扩散出入。样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先从柱中被流动相洗脱出来；中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，在柱中受到滞留，较慢地从色谱柱洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强的滞留，会更慢的被洗脱出；溶解样品的溶剂分子，其分子量最小，可进入凝胶的所有孔洞，从柱中流出，从而实现具有不同分子大小样品的完全分离。在分子排阻色谱法中，溶剂分子从柱中流出，这一点明显不同于其他液相色谱法。相中做相对运动时，经过反复多次的吸附解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的别。

被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。HPLC广泛应用于生命科学、食品科学、物研究以及环境研究中。

液固吸附色谱法中，固定相为固体吸附剂，根据各组分吸附能力异而使组分得以分离。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，大多数用于非离子型化合物。

分子排阻色谱法

分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，它是按照分子尺寸大小顺序进行分离的一种色谱方法。分子排阻色谱法的固定相凝胶是一种多孔性的聚合材料，有一定的形状和稳定性，利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的异而完成分离。

根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可以分为两类：即用水溶剂做流动相的凝胶过滤色谱法（GFC）与用如做流动相的凝胶渗透色谱法（GPC）。

高效液相色谱原理

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(输送压力可达4.07Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

1.高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

5. 适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性、相对分子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

1 .液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同，避免固定液流失)，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。 LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大;但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液 — 液分配色谱法(Rrse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后)，可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。

2 .液 — 固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S)，可表示如下：

式中：Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：

式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

3 .离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/1.凝胶渗透色谱[Cl-]

[讨论：DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

高效液相色谱仪（HPLC）是应用高效液相色谱原理，主要用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物的仪器设备。它由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相） 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。HPLC广泛应用于生命科学、食品科学、物研究以及环境研究中。

储液器中的流动相被高压泵打入检测系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样本溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的“吸附-解吸”的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样本浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式输出检测结果。

根据分离机制的不同，HPLC原理可分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。与反相）、离子交换色谱法及分子排阻色谱法。

1. 液固吸附色谱法

液固吸附色谱法中，固定相为固体吸附剂，根据各组分吸附能力异而使组分得以分离。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，大多数用于非离子型化合物。吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类。对流动相的要求为：

1） 选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。

2） 选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。

4） 选用的溶剂应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。

5） 选用的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。

6） 应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证的安全。

液固色谱法是以表面吸附性能力为依据的，所以它常用于分离极性不同的化合物，也能分离那些具有相同极性基团，但数量不同的样品。

2. 液液分配色谱法

固定相为液体，根据被分离的组分在流动相和固定相中的溶解度不同而分离。依固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱法。正相色谱法采用极性固定相，流动相为相对非极性的疏水性溶剂，常用于分离中等极性和极性较强的化合物；反相色谱法一般用非极性固定相，流动相为水或缓冲溶液，适用于分离非极性和极性较弱的化合物。其中，反相色谱应用最广。

固定相是离子交换树脂。树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

4. 分子排阻色谱法

分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，它是按照分子尺寸大小顺序进行分离的一种色谱方法。分子排阻色谱法的固定相凝胶是一种多孔性的聚合材料，有一定的形状和稳定性，利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的异而完成分离。根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可以分为两类：即用水溶剂做流动相的凝胶过滤色谱法（GFC）与用如做流动相的凝胶渗透色谱法（GPC）。

高效液相色谱仪检测项目

主要是针对有紫外吸收的液体有机物（不饱和的有机物），进行定性和定量分析和纯度分析。

定性：就是保留时间的特征峰。没办法分析出物质结构，但是如果已知物质是X，可以对比待测物质和X标准物质。色谱图显示保留时间一致，确定该物质就是X。多用于鉴别试验中的色谱鉴别。

定量：就是浓度和峰面积成正比。已知物质成分，由标准品的标准曲线计算出待测物质的纯度。多用于含量测定。

纯度分析：这个是根据波长。在某一特定的波长入样品，根据主成分色谱峰和杂质色谱峰的峰面积粗略判断物质的纯度。多用于有关物质测定。

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

如何使用高效液相色谱(HPLC)

凝胶渗透色谱法的原理

化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。 固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。 固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。

凝胶渗透色谱法的原理如下：

凝胶色谱，又称空间排3. 离子交换色谱法阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。

色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子随流动相沿凝胶颗粒外部骇隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透。

小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离目的。

光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶色谱（HFC），而用为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。GPC的分离是利用体积排除机理，装填的是多孔性凝胶或微粒，孔径大小与待分离的聚合物分子相似，体积大的高分子化合物不能进入凝胶孔。

从凝胶粒间流出，淋出体积（时间）最小，高聚物依分子量从大到小依次淋出。这样，通过做已知分子量的高分子聚合物的标准曲线，就能分析同系未知待测高分子化合物了。

原理为分子筛的色谱是

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

凝胶过滤色谱。

色谱分离中的固定相(凝胶)是一种不带电荷的、具有三维空间、多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。

小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质，因整个色谱过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤色谱，又因使用的固定相为凝胶，故又称为凝胶色谱(gel chromatography；gel filtration chromatography; GFC)。

色谱法凝胶过滤色谱（GelFiltrarionChromatography），简称GFC。此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。分类

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性的物质。

LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。

四、色谱分离原理：高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

高效液相色谱法的主要类型有哪些

高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。

1、液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

①液-固色谱法的作用机制

吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：

吸附反应的平衡常数K为：

K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小

流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、、苯、乙腈、、吡啶等。

③液-固色谱法的应用

常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。

2、液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和分离机理反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相 常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。 采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。

使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成Si-O-Si-C型键，把固定液的分子结合到担体表面上。

优点：

④液-液色谱法的应用

液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。

3、离子交换色谱法

原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。

①离子交换色谱法的作用机制

聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。

②溶剂和固定相

两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。

多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。

薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。

③离子交换色谱法的应用

主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。

广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、、蛋白质等)的分离。 4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）

凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。

①凝胶色谱法的作用机制

体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。

凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方5 ．离子色谱法法。

②凝胶色谱法的固定相

软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。

③凝胶色谱法的应用特点

保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。

保留时间短，色谱峰窄，容易检测。

固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。

不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相需在10%以上时才能得到分离。

尿素谱图出现了哪些特征峰?频率分别是多少?

尿素谱图出现的特征峰及频率：CN键、1158；酰胺键、1600+；3） 选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示折光检测器，就不能用梯度洗脱。NH键、3400

色谱的分类一、特点：

1、分配色谱是根据样品中各组分在固定液上分配性能的别来实现分离的一种方法。根据固定相和液体流动相对极性的别，可以分为正相分配色谱和反相分配色谱。正相分配色谱适用于固定相的极性大于流动相的情况，例如正相分配色谱或反相分配色谱。反相分配色谱适用于固定相的极性小于流动相的情况，例如反相分配色谱。

2、离子色谱是一种分析化学技术，通过离子交换剂将样品分子固定在离子交换柱中，然后通过检测离子在固定相中的亲和力来分离离子和极性分子。离子色谱法分为离子交换色谱和离子交换色谱法，它们的区别在于固定相和流动相的异。

3、液相色谱法是一种将液体作为流动相的色谱分析方法，液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性的物质。液相色谱法包括液-液色谱和液固色谱，其中液相色谱中以液体为流动相，而液固色谱中则将固定相至于管子里，这种形式被称为柱色谱。因此，液相色谱法是一种高效、选择性高的色谱分析方法。

4、气相色谱法是一种将气体作为流动相的色谱法，适用于分离挥发性化合物。在气相色谱中，惰性气体(如氦气、氮气、氩气)用作流动相，而样品混合物则作为固定相。通过选择性吸附和检测器识别分离的分子。

6、亲和色谱是一种通过不同基体上的配体与目标分子之间的特异性亲和作用能力来分离生物分子的方法。它利用不同PH值的缓冲溶液作流动相，并根据生物分子与基体上键连的配位体之间的亲和力异来分离混合物。亲和色谱在生物分离中广泛应用。

7、纸色谱法是一种利用滤纸作固定液的色谱法，将试样点在滤纸上，然后以溶剂展开，在滤纸的不同位置上显露成分。根据滤纸上的斑点位置和大小进行定性和定量分析。

分子排阻色谱法的分离机理

X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。

飞秒检测常用的分子排阻色谱法，又称空间排阻色谱法（SEC）是利用多孔凝胶固定相的独特性产生的一种，主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。分子排阻色谱又叫凝胶色谱法。分类 ：凝胶过滤色谱法- GFC （采用水溶液或缓冲液作为流动相）和凝胶渗透色谱法 - GPC（采用作为流动相）。

1、主要取决于凝胶的孔径大小与被分离组分分子尺寸之间的关系，与流动相的性质没有直接的关系。

3、在SEC中，不同尺寸样品分子的分布系数K总保持在0~1之间。K=0 说明溶质完全被排除在填料孔外，称为全排斥，即填料的排斥极限；K=1 说明溶质可完全进入填料孔内。称为全渗透，即填料的渗透极限。

4、对与某一大小分子其洗脱一体积等于流动相体积与该尺寸溶质可以渗透进入空洞内部的那部分体积的总和。Ve=Vo+KVp

固定相：凝胶 按机械强度分 软质凝胶（葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚凝胶）；半刚性凝 胶（-二苯共聚物）；刚性凝胶（高交联度-二苯共聚物、多孔K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]球形硅胶、羟基化聚醚多孔微球）。按化学性质分 有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。

流动相

凝胶渗透色谱法：常用

凝胶过滤色谱法：以水为主体，具有不同PH值得多种缓冲溶液，所有溶剂使用前均要以微孔滤膜或5号砂芯漏斗过滤。除此之外，还需根据所分离的化合物性质向流动相中加入一些添加剂以改善保留和分离效果。如当使用亲水性有机凝胶作为固定相时，为消除体积排阻色谱法中不希望存在的吸附作用与基体的疏水作用，通常在流动相中加入少量的无机盐，以维持流动相的离子强度在0.1—0.5，减少副作用。

1、主要取决于凝胶的孔径大小与被分离组分分子尺寸之间的关系，与流动相的性质没有直接的关系。